Дзякуй за наведванне сайта nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць апошнюю версію браўзера (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, гэты сайт не будзе ўтрымліваць стыляў і JavaScript.
Шкілетныя мышцы — гэта неаднародная тканіна, якая складаецца пераважна з міяфібрыл, якія ў людзей звычайна класіфікуюцца на тры тыпы: адзін «павольны» (тып 1) і два «хуткія» (тыпы 2A і 2X). Аднак неаднароднасць паміж традыцыйнымі тыпамі міяфібрыл і ўнутры іх застаецца недастаткова вывучанай. Мы ўжылі транскрыптомны і пратэомны падыходы да 1050 і 1038 асобных міяфібрыл з латэральнай шырокай мышцы галавы чалавека адпаведна. У пратэомнае даследаванне былі ўключаны мужчыны, а ў транскрыптомнае даследаванне — 10 мужчын і 2 жанчыны. Акрамя ізаформ цяжкіх ланцугоў міязіну, мы вызначылі метабалічныя бялкі, рыбасомныя бялкі і клеткавыя злучальныя бялкі як крыніцы шматмернай зменлівасці міжміяфібрыл. Больш за тое, нягледзячы на ідэнтыфікацыю кластараў павольных і хуткіх валокнаў, нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што валокны тыпу 2X фенатыпічна не адрозніваюцца ад іншых хуткіх валокнаў. Больш за тое, класіфікацыя на аснове цяжкіх ланцугоў міязіну недастатковая для апісання фенатыпу міяфібрыл пры немалінавых міяпатыях. У цэлым, нашы дадзеныя сведчаць аб шматмернай гетэрагеннасці міяфібраў, прычым крыніцы варыяцый выходзяць за рамкі ізаформ цяжкіх ланцугоў міязіну.
Клетачная гетэрагеннасць з'яўляецца ўласцівай усім біялагічным сістэмам, што дазваляе клеткам спецыялізавацца для задавальнення розных патрэб тканін і клетак.1 Традыцыйны погляд на гетэрагеннасць валокнаў шкілетных цягліц заключаўся ў тым, што рухальныя нейроны вызначаюць тып валокнаў унутры рухальнай адзінкі, і што тып валокнаў (г.зн. тып 1, тып 2A і тып 2X у людзей) вызначаецца характарыстыкамі ізаформ цяжкіх ланцугоў міязіну (MYH).2 Спачатку гэта было заснавана на іх нестабільнасці pH-АТФазы,3,4 а пазней на іх малекулярнай экспрэсіі MYH.5 Аднак з ідэнтыфікацыяй і наступным прыняццем «змешаных» валокнаў, якія сумесна экспрэсуюць некалькі MYH у розных прапорцыях, валокны шкілетных цягліц усё часцей разглядаюцца як кантынуум, а не як асобныя тыпы валокнаў.6 Нягледзячы на гэта, гэтая галіна ўсё яшчэ ў значнай ступені абапіраецца на MYH як асноўны класіфікатар для класіфікацыі міяфібрыл, погляд, верагодна, на які паўплывалі абмежаванні і значныя прадузятасці ранніх даследаванняў на грызунах, чые профілі экспрэсіі MYH і дыяпазон тыпаў валокнаў адрозніваюцца ад такіх у людзей.2 Сітуацыя яшчэ больш ускладняецца тым, што розныя шкілетныя мышцы чалавека дэманструюць разнастайны дыяпазон тыпаў валокнаў.7 Вялізны мускул lateralis — гэта змяшаная мышца з прамежкавым (і таму рэпрэзентатыўным) профілем экспрэсіі MYH.7 Акрамя таго, лёгкасць адбору проб робіць яе найбольш вывучанай мышцай у людзей.
Такім чынам, непрадузятае даследаванне разнастайнасці валокнаў шкілетных цягліц з выкарыстаннем магутных інструментаў «омікі» з'яўляецца крытычна важным, але ў той жа час складаным, часткова з-за шмат'ядравай прыроды валокнаў шкілетных цягліц. Аднак тэхналогіі транскрыптомікі8,9 і пратэомікі10 у апошнія гады зведалі рэвалюцыю ў адчувальнасці дзякуючы розным тэхналагічным дасягненням, што дазваляе аналізаваць шкілетныя мышцы з дазволам аднаго валокна. У выніку быў дасягнуты значны прагрэс у характарыстыцы разнастайнасці аднаго валокна і іх рэакцыі на атрафічныя раздражняльнікі і старэнне11,12,13,14,15,16,17,18. Важна адзначыць, што гэтыя тэхналагічныя дасягненні маюць клінічнае прымяненне, што дазваляе больш падрабязна і дакладна характарызаваць парушэнне рэгуляцыі, звязанае з захворваннямі. Напрыклад, патафізіялогія немалінавай міяпатыі, аднаго з найбольш распаўсюджаных спадчынных захворванняў цягліц (MIM 605355 і MIM 161800), з'яўляецца складанай і заблытанай.19,20 Такім чынам, лепшая характарыстыка парушэння рэгуляцыі валокнаў шкілетных цягліц можа прывесці да значнага прагрэсу ў нашым разуменні гэтага захворвання.
Мы распрацавалі метады транскрыптомнага і пратэомнага аналізу асобных валокнаў шкілетных цягліц, уручную выдзеленых з біяпсіі чалавека, і ўжылі іх да тысяч валокнаў, што дазволіла нам даследаваць клетачную гетэрагеннасць валокнаў шкілетных цягліц чалавека. У ходзе гэтай працы мы прадэманстравалі магутнасць транскрыптомнага і пратэомнага фенатыпавання цягліцавых валокнаў і вызначылі метабалічныя, рыбасомныя і клетачныя злучальныя бялкі як значныя крыніцы міжвалакновай зменлівасці. Акрамя таго, выкарыстоўваючы гэты пратэомны працоўны працэс, мы ахарактарызавалі клінічную значнасць нематоднай міяпатыі ў асобных валокнах шкілетных цягліц, выявіўшы скаардынаваны зрух у бок неакісляльных валокнаў незалежна ад тыпу валокнаў на аснове MYH.
Каб даследаваць гетэрагеннасць валокнаў шкілетных цягліц чалавека, мы распрацавалі два працоўныя працэсы, якія дазваляюць праводзіць транскрыптомны і пратэомны аналіз асобных валокнаў шкілетных цягліц (малюнак 1А і дадатковы малюнак 1А). Мы распрацавалі і аптымізавалі некалькі метадалагічных этапаў, ад захоўвання ўзораў і захавання цэласнасці РНК і бялкоў да аптымізацыі прапускной здольнасці для кожнага падыходу. Для аналізу транскрыптомаў гэта было дасягнута шляхам устаўкі малекулярных штрых-кодаў, спецыфічных для ўзору, на пачатковым этапе зваротнай транскрыпцыі, што дазволіла аб'яднаць 96 валокнаў для эфектыўнай далейшай апрацоўкі. Больш глыбокае секвенаванне (±1 мільён прачытанняў на валакно) у параўнанні з традыцыйнымі падыходамі да асобных клетак яшчэ больш узбагаціла транскрыптомныя дадзеныя.21 Для пратэомікі мы выкарыстоўвалі кароткі храматаграфічны градыент (21 хвіліна) у спалучэнні з набыццём дадзеных DIA-PASEF на мас-спектрометры timsTOF для аптымізацыі глыбіні пратэома пры захаванні высокай прапускной здольнасці. 22,23 Каб даследаваць гетэрагеннасць здаровых шкілетных мышачных валокнаў, мы ахарактарызавалі транскрыптомы 1050 асобных валокнаў ад 14 здаровых дарослых донараў і пратэомы 1038 валокнаў ад 5 здаровых дарослых донараў (Дадатковая табліца 1). У гэтай працы гэтыя наборы даных называюцца транскрыптомамі і пратэомамі 1000 валокнаў адпаведна. Наш падыход дазволіў выявіць у агульнай складанасці 27 237 транскрыптаў і 2983 бялкі ў транскрыптомным і пратэомным аналізе 1000 валокнаў (Малюнак 1А, Дадатковыя наборы даных 1–2). Пасля фільтрацыі транскрыптомных і пратэомных набораў даных для выяўлення >1000 генаў і 50% дапушчальных значэнняў на валакно былі праведзены наступныя біяінфарматычныя аналізы для 925 і 974 валокнаў у транскрыптоме і пратэоме адпаведна. Пасля фільтрацыі ў сярэднім на адно валакно было выяўлена 4257 ± 1557 генаў і 2015 ± 234 бялкоў (сярэдняе значэнне ± стандартнае адхіленне) з абмежаванай міжіндывідуальнай зменлівасцю (дадатковыя малюнкі 1B–C, дадатковыя наборы дадзеных 3–4). Аднак унутрыіндывідуальная зменлівасць была больш выяўленай у розных удзельнікаў, верагодна, з-за адрозненняў у выхадзе РНК/бялку паміж валокнамі рознай даўжыні і плошчы папярочнага сячэння. Для большасці бялкоў (>2000) каэфіцыент варыяцыі быў ніжэй за 20% (дадатковы малюнак 1D). Абодва метады дазволілі зафіксаваць шырокі дынамічны дыяпазон транскрыптаў і бялкоў з высока выяўленымі сігнатурамі, важнымі для скарачэння цягліц (напрыклад, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (дадатковыя малюнкі 1E–F). Большасць выяўленых прыкмет былі агульнымі паміж транскрыптомнымі і пратэомнымі наборамі дадзеных (дадатковы малюнак 1G), і сярэднія інтэнсіўнасці UMI/LFQ гэтых прыкмет былі дастаткова добра карэляваныя (r = 0,52) (дадатковы малюнак 1H).
Працоўны працэс транскрыптамікі і пратэомікі (створаны з дапамогай BioRender.com). BD Крывыя дынамічнага дыяпазону для MYH7, MYH2 і MYH1, а таксама разлічаныя парогі для прызначэння тыпу валокнаў. E, F Размеркаванне экспрэсіі MYH па валокнах у наборах даных транскрыптамікі і пратэомікі. G, H Дыяграмы набліжэння і праекцыі аднастайнай разнастайнасці (UMAP) для транскрыптамікі і пратэомікі, афарбаваныя ў адпаведнасці з тыпам валокнаў на аснове MYH. I, J Дыяграмы характарыстык, якія паказваюць экспрэсію MYH7, MYH2 і MYH1 у наборах даных транскрыптамікі і пратэомікі.
Спачатку мы паставілі сабе за мэту прызначыць кожнаму валакну тып валокнаў на аснове MYH, выкарыстоўваючы аптымізаваны падыход, які выкарыстоўвае высокую адчувальнасць і дынамічны дыяпазон экспрэсіі MYH у наборах дадзеных omics. У папярэдніх даследаваннях выкарыстоўваліся адвольныя парогі для маркіроўкі валокнаў як чыстых тыпу 1, тыпу 2A, тыпу 2X або змешаных на аснове фіксаванага працэнта экспрэсіі розных MYH11,14,24. Мы выкарысталі іншы падыход, пры якім экспрэсія кожнага валакна ранжыравалася па MYH, якія мы выкарыстоўвалі для тыпізацыі валокнаў: MYH7, MYH2 і MYH1, што адпавядае валокнам тыпу 1, тыпу 2A і тыпу 2X адпаведна. Затым мы матэматычна разлічылі ніжнюю кропку перагіну кожнай атрыманай крывой і выкарысталі яе ў якасці парога для прызначэння валокнаў як станоўчых (вышэй за парог) або адмоўных (ніжэй за парог) для кожнага MYH (малюнак 1B–D). Гэтыя дадзеныя паказваюць, што MYH7 (малюнак 1B) і MYH2 (малюнак 1C) маюць больш выразныя профілі экспрэсіі ўключэння/выключэння на ўзроўні РНК у параўнанні з узроўнем бялку. І сапраўды, на ўзроўні бялку вельмі мала валокнаў не экспрэсавалі MYH7, і ніводнае валакно не мела 100% экспрэсіі MYH2. Далей мы выкарысталі загадзя вызначаныя парогі экспрэсіі, каб прызначыць тыпы валокнаў на аснове MYH усім валокнам у кожным наборы дадзеных. Напрыклад, валокны MYH7+/MYH2-/MYH1- былі аднесены да тыпу 1, у той час як валокны MYH7-/MYH2+/MYH1+ былі аднесены да змешанага тыпу 2A/2X (поўнае апісанне гл. у Дадатковай табліцы 2). Аб'яднаўшы ўсе валокны, мы назіралі надзвычай падобнае размеркаванне тыпаў валокнаў на аснове MYH як на ўзроўні РНК (малюнак 1E), так і на ўзроўні бялку (малюнак 1F), у той час як адносны склад тыпаў валокнаў на аснове MYH вар'іраваў у розных людзей, як і чакалася (дадатковы малюнак 2A). Большасць валокнаў былі класіфікаваны альбо як чысты тып 1 (34–35%), альбо як тып 2A (36–38%), хоць была выяўлена і значная колькасць змешаных валокнаў тыпу 2A/2X (16–19%). Дзіўнае адрозненне заключаецца ў тым, што чыстыя валокны тыпу 2X можна было выявіць толькі на ўзроўні РНК, але не на ўзроўні бялку, што сведчыць аб тым, што хуткая экспрэсія MYH прынамсі часткова рэгулюецца посттранскрыпцыйна.
Мы праверылі наш метад тыпізацыі валокнаў MYH на аснове пратэомікі з выкарыстаннем дот-блотынгу на аснове антыцелаў, і абодва метады дасягнулі 100% супадзення ў ідэнтыфікацыі чыстых валокнаў тыпу 1 і тыпу 2A (гл. дадатковы малюнак 2B). Аднак падыход на аснове пратэомікі быў больш адчувальным, больш эфектыўным у ідэнтыфікацыі змешаных валокнаў і колькаснай ацэнцы долі кожнага гена MYH у кожным валокне. Гэтыя дадзеныя дэманструюць эфектыўнасць выкарыстання аб'ектыўнага, высокаадчувальнага падыходу на аснове омікі для характарыстыкі тыпаў валокнаў шкілетных цягліц.
Затым мы выкарысталі аб'яднаную інфармацыю, атрыманую з дапамогай транскрыптомікі і пратэомікі, для аб'ектыўнай класіфікацыі міявалакнін на аснове іх поўнага транскрыптома або пратэома. Выкарыстоўваючы метад набліжэння і праекцыі раўнамернай мнагастайнасці (UMAP) для памяншэння памернасці да шасці галоўных кампанент (дадатковыя малюнкі 3A–B), мы змаглі візуалізаваць зменлівасць міявалакнін у транскрыптоме (малюнак 1G) і пратэоме (малюнак 1H). Прыкметна, што міявалакніны не былі згрупаваны па ўдзельніках (дадатковыя малюнкі 3C–D) або днях тэсціравання (дадатковы малюнак 3E) ні ў наборах дадзеных транскрыптомікі, ні ў наборах дадзеных пратэомікі, што сведчыць аб тым, што ўнутрысуб'ектная зменлівасць валокнаў шкілетных цягліц вышэйшая, чым міжсуб'ектная зменлівасць. На графіку UMAP з'явіліся два розныя кластары, якія прадстаўляюць «хуткія» і «павольныя» міявалакніны (малюнкі 1G–H). Міявалакна MYH7+ (павольныя) былі кластарызаваны на станоўчым полюсе UMAP1, у той час як міявалакна MYH2+ і MYH1+ (хуткія) былі кластарызаваны на адмоўным полюсе UMAP1 (малюнкі 1I–J). Аднак не было зроблена адрознення паміж тыпамі хуткіх валокнаў (г.зн. тып 2A, тып 2X або змешаныя 2A/2X) на аснове экспрэсіі MYH, што сведчыць аб тым, што экспрэсія MYH1 (малюнак 1I–J) або іншых класічных маркераў міявалакнаў 2X, такіх як ACTN3 або MYLK2 (дадатковыя малюнкі 4A–B), не адрознівае розныя тыпы міявалакнаў пры разглядзе ўсяго транскрыпта або пратэома. Больш за тое, у параўнанні з MYH2 і MYH7, некалькі транскрыптаў або бялкоў станоўча карэлявалі з MYH1 (дадатковыя малюнкі 4C–H), што сведчыць аб тым, што колькасць MYH1 не цалкам адлюстроўвае транскрыпта/пратэом міявалакнаў. Падобныя высновы былі зроблены пры ацэнцы змешанай экспрэсіі трох ізаформ MYH на ўзроўні UMAP (дадатковыя мал. 4I–J). Такім чынам, у той час як валокны 2X можна ідэнтыфікаваць на ўзроўні транскрыптаў толькі на аснове колькаснага вызначэння MYH, валокны MYH1+ нельга адрозніць ад іншых хуткіх валокнаў пры разглядзе ўсяго транскрыпта або пратэома.
У якасці пачатковага даследавання гетэрагеннасці павольных валокнаў па-за межамі MYH, мы ацанілі чатыры ўстаноўленыя тыпаспецыфічныя бялкі павольных валокнаў: TPM3, TNNT1, MYL3 і ATP2A22. Падтыпы павольных валокнаў паказалі высокія, хоць і не ідэальныя, карэляцыі Пірсана з MYH7 як у транскрыптоміцы (Дадатковы малюнак 5A), так і ў пратэоміцы (Дадатковы малюнак 5B). Прыблізна 25% і 33% павольных валокнаў не былі класіфікаваны як чыстыя павольныя валокны па ўсіх падтыпах генаў/бялкоў у транскрыптоміцы (Дадатковы малюнак 5C) і пратэоміцы (Дадатковы малюнак 5D) адпаведна. Такім чынам, класіфікацыя павольных валокнаў на аснове некалькіх падтыпаў генаў/бялкоў уносіць дадатковую складанасць, нават для бялкоў, якія, як вядома, з'яўляюцца тыпаспецыфічнымі для валокнаў. Гэта сведчыць аб тым, што класіфікацыя валокнаў на аснове ізаформ аднаго сямейства генаў/бялкоў можа не адэкватна адлюстроўваць сапраўдную гетэрагеннасць валокнаў шкілетных цягліц.
Каб далей даследаваць фенатыпічную зменлівасць валокнаў шкілетных цягліц чалавека ў маштабе ўсёй мадэлі omics, мы правялі незрушанае зніжэнне памернасці дадзеных з выкарыстаннем аналізу галоўных кампанент (PCA) (малюнак 2A). Падобна да графікаў UMAP, ні ўдзельнік, ні дзень тэставання не ўплывалі на кластарызацыю валокнаў на ўзроўні PCA (дадатковыя малюнкі 6A–C). У абодвух наборах дадзеных тып валокнаў на аснове MYH быў растлумачаны PC2, які паказаў кластар павольных валокнаў тыпу 1 і другі кластар, які змяшчае хуткаскарачальныя валокны тыпу 2A, тыпу 2X і змешаныя валокны 2A/2X (малюнак 2A). У абодвух наборах дадзеных гэтыя два кластары былі злучаны невялікай колькасцю змешаных валокнаў тыпу 1/2A. Як і чакалася, аналіз празмернай прадстаўленасці асноўных драйвераў PC пацвердзіў, што PC2 быў кіруемы скарачальнымі і метабалічнымі сігнатурамі (малюнак 2B і дадатковыя малюнкі 6D–E, дадатковыя наборы дадзеных 5–6). У цэлым, тып валокнаў на аснове MYH аказаўся дастатковым для тлумачэння бесперапыннай варыяцыі ўздоўж PC2, за выключэннем так званых 2X валокнаў, якія былі размеркаваны па ўсім транскрыптоме ў межах хуткага кластара.
A. Дыяграмы аналізу галоўных кампанент (PCA) набораў дадзеных транскрыптомаў і пратэомаў, афарбаваныя ў адпаведнасці з тыпам валокнаў на аснове MYH. B. Аналіз узбагачэння драйвераў транскрыптаў і бялкоў у PC2 і PC1. Статыстычны аналіз быў выкананы з выкарыстаннем пакета clusterProfiler і p-значэнняў, скарэкціраваных па Бенджаміні-Хохбергу. C, D. Дыяграмы PCA, афарбаваныя ў адпаведнасці з тэрмінамі анталогіі генаў міжклеткавай адгезіі (GO) у транскрыптоме і тэрмінамі GO костамераў у пратэоме. Стрэлкі адлюстроўваюць драйверы транскрыптаў і бялкоў і іх кірункі. E, F. Дыяграмы набліжэння і праекцыі аднастайнай мнагастайнасці (UMAP) паказваюць клінічна значныя характарыстыкі, якія паказваюць градыенты экспрэсіі незалежна ад тыпу павольных/хуткіх валокнаў. G, H. Карэляцыі паміж драйверамі PC2 і PC1 у транскрыптомах і пратэомах.
Нечакана, тып міяфібр на аснове MYH тлумачыць толькі другую па велічыні ступень зменлівасці (PC2), што сведчыць аб тым, што іншыя біялагічныя фактары, не звязаныя з тыпам міяфібр на аснове MYH (PC1), гуляюць важную ролю ў рэгуляцыі гетэрагеннасці валокнаў шкілетных цягліц. Аналіз празмернай прадстаўленасці галоўных драйвераў у PC1 паказаў, што зменлівасць у PC1 у першую чаргу вызначалася міжклеткавай адгезіяй і ўтрыманнем рыбасом у транскрыптоме, а таксама костамерамі і рыбасомнымі бялкамі ў пратэоме (малюнак 2B і дадатковыя малюнкі 6D–E, дадатковы набор дадзеных 7). У шкілетных цягліцах костамеры злучаюць Z-дыск з саркалемай і ўдзельнічаюць у перадачы сілы і сігналізацыі. 25 Анатаваныя графікі PCA з выкарыстаннем асаблівасцей міжклеткавай адгезіі (транскрыптом, малюнак 2C) і костамераў (пратэом, малюнак 2D) выявілі моцны зрух улева ў PC1, што сведчыць аб тым, што гэтыя асаблівасці ўзбагачаны пэўнымі валокнамі.
Больш падрабязнае вывучэнне кластарызацыі міяфібр на ўзроўні UMAP паказала, што большасць прыкмет дэманструюць незалежны ад тыпу міяфібр градыент экспрэсіі на аснове MYH, а не спецыфічны для падкластараў міяфібр. Гэтая бесперапыннасць назіралася для некалькіх генаў, звязаных з паталагічнымі станамі (малюнак 2E), такіх як CHCHD10 (нервова-мышачныя захворванні), SLIT3 (цягліцавая атрафія), CTDNEP1 (цягліцавыя захворванні). Гэтая бесперапыннасць таксама назіралася па ўсім пратэоме, уключаючы бялкі, звязаныя з неўралагічнымі засмучэннямі (UGDH), інсулінавай сігналізацыяй (PHIP) і транскрыпцыяй (HIST1H2AB) (малюнак 2F). У сукупнасці гэтыя дадзеныя сведчаць аб бесперапыннасці ў незалежнай ад тыпу валокнаў гетэрагеннасці павольных/хуткіх скарачэнняў паміж рознымі міяфібрлінамі.
Цікава, што гены-драйверы ў PC2 прадэманстравалі добрую карэляцыю транскрыптом-пратэом (r = 0,663) (малюнак 2G), што сведчыць аб тым, што тыпы павольных і хуткіх валокнаў, і ў прыватнасці скарачальныя і метабалічныя ўласцівасці валокнаў шкілетных цягліц, рэгулююцца транскрыпцыйна. Аднак гены-драйверы ў PC1 не прадэманстравалі карэляцыі транскрыптом-пратэом (r = -0,027) (малюнак 2H), што сведчыць аб тым, што варыяцыі, не звязаныя з тыпамі павольных/хуткіх валокнаў, у значнай ступені рэгулююцца посттранскрыпцыйна. Паколькі варыяцыі ў PC1 у першую чаргу тлумачыліся тэрмінамі анталогіі рыбасомных генаў, і ўлічваючы, што рыбасомы гуляюць вырашальную і спецыялізаваную ролю ў клетцы, актыўна ўдзельнічаючы ў трансляцыі бялкоў і ўплываючы на яе,31 мы далей вырашылі даследаваць гэтую нечаканую гетэрагеннасць рыбасом.
Спачатку мы размалявалі графік аналізу галоўных кампанент пратэомікі ў адпаведнасці з адноснай колькасцю бялкоў у тэрміне GOCC «цытаплазматычная рыбасома» (малюнак 3A). Нягледзячы на тое, што гэты тэрмін узбагачаны з станоўчага боку PC1, што прыводзіць да невялікага градыенту, рыбасомныя бялкі кіруюць падзелам у абодвух напрамках PC1 (малюнак 3A). Рыбасомныя бялкі, узбагачаныя з адмоўнага боку PC1, уключалі RPL18, RPS18 і RPS13 (малюнак 3B), у той час як RPL31, RPL35 і RPL38 (малюнак 3C) былі асноўнымі рухаючымі сіламі з станоўчага боку PC1. Цікава, што RPL38 і RPS13 высока экспрэсаваліся ў шкілетных мышцах у параўнанні з іншымі тканінамі (дадатковы малюнак 7A). Гэтыя адметныя рыбасомныя сігнатуры ў PC1 не назіраліся ў транскрыптоме (дадатковы малюнак 7B), што сведчыць аб посттранскрыпцыйнай рэгуляцыі.
A. Графік аналізу галоўных кампанент (PCA), афарбаваны ў адпаведнасці з тэрмінамі цытаплазматычнай рыбасомнай геннай анталогіі (GO) па ўсім пратэоме. Стрэлкі паказваюць кірунак зменлівасці, апасродкаванай бялком, на графіку PCA. Даўжыня лініі адпавядае балу галоўных кампанент для дадзенага бялку. B, C. Графікі характарыстык PCA для RPS13 і RPL38. D. Неназіраны іерархічны кластарызацыйны аналіз цытаплазматычных рыбасомных бялкоў. E. Структурная мадэль рыбасомы 80S (PDB: 4V6X), якая вылучае рыбасомныя бялкі з рознай колькасцю ў валокнах шкілетных цягліц. F. Рыбасомныя бялкі з рознай стехіаметрыяй, лакалізаваныя паблізу канала выхаду мРНК.
Раней былі прапанаваны канцэпцыі гетэрагеннасці і спецыялізацыі рыбасом, згодна з якімі наяўнасць розных субпапуляцый рыбасом (гетэрагеннасць рыбасом) можа непасрэдна ўплываць на трансляцыю бялкоў у розных тканінах32 і клетках33 праз селектыўную трансляцыю спецыфічных пулаў транскрыптаў мРНК34 (спецыялізацыя рыбасом). Каб вызначыць субпапуляцыі рыбасомных бялкоў, якія сумесна экспрэсуюцца ў валокнах шкілетных мышцаў, мы правялі некантраляваны іерархічны кластарызацыйны аналіз рыбасомных бялкоў у пратэоме (малюнак 3D, дадатковы набор дадзеных 8). Як і чакалася, рыбасомныя бялкі не кластарызаваліся па тыпу валокнаў на аснове MYH. Аднак мы вызначылі тры розныя кластары рыбасомных бялкоў; першы кластар (ribosomal_cluster_1) сурэгулюецца з RPL38 і, такім чынам, мае павышаную экспрэсію ў валокнах з станоўчым профілем PC1. Другі кластар (ribosomal_cluster_2) сурэгулюецца з RPS13 і павышаны ў валокнах з адмоўным профілем PC1. Трэці кластар (ribosomal_cluster_3) не праяўляе каардынаванай дыферэнцыяльнай экспрэсіі ў валокнах шкілетных мышцаў і можа лічыцца «асноўным» рыбасомным бялком шкілетных мышцаў. Абодва рыбасомныя кластары 1 і 2 утрымліваюць рыбасомныя бялкі, якія, як было паказана раней, рэгулююць альтэрнатыўную трансляцыю (напрыклад, RPL10A, RPL38, RPS19 і RPS25) і функцыянальна ўплываюць на развіццё (напрыклад, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 У адпаведнасці з вынікамі PCA, назіраная неаднародная прадстаўніцтва гэтых рыбасомных бялкоў па валокнах таксама паказала бесперапыннасць (Дадатковы малюнак 7C).
Каб візуалізаваць размяшчэнне гетэрагенных рыбасомных бялкоў унутры рыбасомы, мы выкарысталі структурную мадэль рыбасомы чалавека 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Малюнак 3E). Пасля вылучэння рыбасомных бялкоў, якія належаць да розных рыбасомных кластараў, іх размяшчэнне не было цесна супадаць, што сведчыць аб тым, што наш падыход не забяспечыў узбагачэнне пэўных рэгіёнаў/фракцый рыбасомы. Цікава, аднак, што доля бялкоў вялікіх субадзінак у кластары 2 была ніжэйшай, чым у кластарах 1 і 3 (Дадатковы малюнак 7D). Мы назіралі, што бялкі са змененай стехіаметрыяй у валокнах шкілетных цягліц былі пераважна лакалізаваны на паверхні рыбасомы (Малюнак 3E), што адпавядае іх здольнасці ўзаемадзейнічаць з элементамі ўнутранага сайта ўваходу рыбасомы (IRES) у розных папуляцыях мРНК, тым самым каардынуючы селектыўную трансляцыю.40,41 Акрамя таго, многія бялкі са змененай стехіаметрыяй у валокнах шкілетных цягліц былі размешчаны паблізу функцыянальных абласцей, такіх як тунэль выхаду мРНК (Малюнак 3F), якія селектыўна рэгулююць трансляцыйнае падаўжэнне і арышт спецыфічных пептыдаў. 42 Карацей кажучы, нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што стехіаметрыя рыбасомных бялкоў шкілетных мышцаў праяўляе неаднароднасць, што прыводзіць да адрозненняў паміж валокнамі шкілетных мышцаў.
Далей мы паставілі сабе за мэту вызначыць сігнатуры хуткіх і павольных валокнаў і даследаваць механізмы іх транскрыпцыйнай рэгуляцыі. Параўноўваючы кластары хуткіх і павольных валокнаў, вызначаныя UMAP у двух наборах дадзеных (малюнкі 1G–H і 4A–B), транскрыптомны і пратэомны аналізы выявілі 1366 і 804 дыферэнцыяльна распаўсюджаныя характарыстыкі адпаведна (малюнкі 4A–B, дадатковыя наборы дадзеных 9–12). Мы назіралі чаканыя адрозненні ў сігнатурах, звязаных з саркамерамі (напрыклад, трапаміязін і трапанін), сувяззю ўзбуджэння-скарачэння (ізаформы SERCA) і энергетычным метабалізмам (напрыклад, ALDOA і CKB). Больш за тое, транскрыпты і бялкі, якія рэгулююць убиквитинирование бялкоў, былі дыферэнцыяльна экспрэсаваны ў хуткіх і павольных валокнах (напрыклад, USP54, SH3RF2, USP28 і USP48) (малюнкі 4A–B). Больш за тое, ген мікробнага бялку RP11-451G4.2 (DWORF), які раней, як было паказана, дыферэнцыяльна экспрэсуецца ў розных тыпах мышачных валокнаў ягняці43 і ўзмацняе актыўнасць SERCA ў сардэчнай мышцы44, быў значна павышаны ў павольных шкілетных мышачных валокнах (малюнак 4A). Падобным чынам, на ўзроўні асобных валокнаў назіраліся значныя адрозненні ў вядомых сігнатурах, такіх як ізаформы лактатдэгідрагеназы, звязаныя з метабалізмам (LDHA і LDHB, малюнак 4C і дадатковы малюнак 8A)45,46, а таксама раней невядомыя спецыфічныя для тыпу валокнаў сігнатуры (такія як IRX3, USP54, USP28 і DPYSL3) (малюнак 4C). Назіралася значнае перакрыццё дыферэнцыяльна экспрэсаваных прыкмет паміж транскрыптомнымі і пратэомнымі наборамі дадзеных (дадатковы малюнак 8B), а таксама карэляцыя кратнага змянення, абумоўленая ў асноўным больш выяўленай дыферэнцыяльнай экспрэсіяй саркамерных прыкмет (дадатковы малюнак 8C). Варта адзначыць, што некаторыя сігнатуры (напрыклад, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) прадэманстравалі моцную посттранскрыпцыйную рэгуляцыю толькі на пратэомным узроўні і мелі спецыфічныя для тыпу валокнаў профілі экспрэсіі павольнага/хуткага скарачэння (дадатковы малюнак 8C).
Дыяграмы вулканаў A і B, якія параўноўваюць павольныя і хуткія кластары, ідэнтыфікаваныя з дапамогай графікаў набліжэння і праекцыі аднастайнай мнагастайнасці (UMAP) на малюнках 1G–H. Каляровыя кропкі прадстаўляюць транскрыпты або бялкі, якія значна адрозніваюцца пры FDR < 0,05, а больш цёмныя кропкі прадстаўляюць транскрыпты або бялкі, якія значна адрозніваюцца пры логарытмічнаму змене > 1. Двухбаковы статыстычны аналіз быў праведзены з выкарыстаннем тэсту Вальда DESeq2 са скарэкціраванымі па Бенджаміні-Хохбергу значэннямі p (транскрыптоміка) або метаду лінейнай мадэлі Лімы з эмпірычным байесаўскім аналізам з наступнай карэкціроўкай Бенджаміні-Хохберга для множных параўнанняў (пратэоміка). C Дыяграмы сігнатур выбраных дыферэнцыяльна экспрэсаваных генаў або бялкоў паміж павольнымі і хуткімі валокнамі. D Аналіз узбагачэння значна дыферэнцыяльна экспрэсаваных транскрыптаў і бялкоў. Перакрываючыяся значэнні ўзбагачаюцца ў абодвух наборах дадзеных, значэнні транскрыптома ўзбагачаюцца толькі ў транскрыптоме, а значэнні пратэома ўзбагачаюцца толькі ў пратэоме. Статыстычны аналіз быў праведзены з выкарыстаннем пакета clusterProfiler са скарэкціраванымі па Бенджаміні-Хохбергу значэннямі p. E. Транскрыпцыйныя фактары, спецыфічныя для тыпу валокнаў, ідэнтыфікаваныя SCENIC на аснове атрыманых SCENIC балаў спецыфічнасці рэгулятараў і дыферэнцыяльнай экспрэсіі мРНК паміж тыпамі валокнаў. F. Прафіляванне выбраных транскрыпцыйных фактараў, дыферэнцыяльна экспрэсаваных паміж павольнымі і хуткімі валокнамі.
Затым мы правялі аналіз празмернай прадстаўленасці дыферэнцыяльна прадстаўленых генаў і бялкоў (малюнак 4D, дадатковы набор дадзеных 13). Узбагачэнне шляхоў для характарыстык, якія адрозніваліся паміж двума наборамі дадзеных, выявіла чаканыя адрозненні, такія як працэсы β-акіслення тоўстых кіслот і метабалізму кетонаў (павольныя валокны), скарачэнне міяфіламентаў/цягліц (хуткія і павольныя валокны адпаведна) і катабалічныя працэсы вугляводаў (хуткія валокны). Актыўнасць серын/трэанін-пратэінфасфатазы таксама была павышана ў хуткіх валокнах, што было абумоўлена такімі характарыстыкамі, як рэгуляторныя і каталітычныя субадзінкі фасфатазы (PPP3CB, PPP1R3D і PPP1R3A), якія, як вядома, рэгулююць метабалізм глікагену (47) (дадатковыя малюнкі 8D–E). Іншыя шляхі, узбагачаныя хуткімі валокнамі, уключалі працэсінгавыя (P-) цельцы (YTHDF3, TRIM21, LSM2) у пратэоме (дадатковы малюнак 8F), якія патэнцыйна ўдзельнічаюць у посттранскрыпцыйнай рэгуляцыі (48), і актыўнасць транскрыпцыйных фактараў (SREBF1, RXRG, RORA) у транскрыптоме (дадатковы малюнак 8G). Павольныя валокны былі ўзбагачаны актыўнасцю аксідарэдуктазы (BDH1, DCXR, TXN2) (дадатковы малюнак 8H), звязваннем аміду (CPTP, PFDN2, CRYAB) (дадатковы малюнак 8I), пазаклеткавым матрыксам (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (дадатковы малюнак 8J) і актыўнасцю рэцэптар-ліганд (FNDC5, SPX, NENF) (дадатковы малюнак 8K).
Каб лепш зразумець рэгуляцыю транскрыпцыі, якая ляжыць у аснове характарыстык тыпаў павольных/хуткіх мышачных валокнаў, мы правялі аналіз узбагачэння транскрыпцыйных фактараў з выкарыстаннем SCENIC49 (дадатковы набор дадзеных 14). Многія транскрыпцыйныя фактары былі значна ўзбагачаны паміж хуткімі і павольнымі мышачнымі валокнамі (малюнак 4E). Сюды ўваходзілі транскрыпцыйныя фактары, такія як MAFA, які раней быў звязаны з развіццём хуткіх мышачных валокнаў,50, а таксама некалькі транскрыпцыйных фактараў, якія раней не былі звязаны са спецыфічнымі для тыпу мышачных валокнаў геннымі праграмамі. Сярод іх PITX1, EGR1 і MYF6 былі найбольш узбагачанымі транскрыпцыйнымі фактарамі ў хуткіх мышачных валокнах (малюнак 4E). Наадварот, ZSCAN30 і EPAS1 (таксама вядомы як HIF2A) былі найбольш узбагачанымі транскрыпцыйнымі фактарамі ў павольных мышачных валокнах (малюнак 4E). У адпаведнасці з гэтым, MAFA экспрэсаваўся на больш высокіх узроўнях у вобласці UMAP, якая адпавядае хуткім мышачным валокнам, у той час як EPAS1 меў супрацьлеглы характар экспрэсіі (малюнак 4F).
Акрамя вядомых генаў, якія кадуюць бялкі, існуе мноства некадзіруючых біятыпаў РНК, якія могуць быць удзельнічаць у рэгуляцыі развіцця і захворванняў чалавека.51, 52 У наборах транскрыптомных дадзеных некалькі некадзіруючых РНК праяўляюць спецыфічнасць да тыпу валокнаў (малюнак 5А і дадатковы набор дадзеных 15), у тым ліку LINC01405, якая з'яўляецца высокаспецыфічнай для павольных валокнаў і, як паведамляецца, зніжаецца ў цягліцах пацыентаў з мітахандрыяльнай міяпатыяй.53 Наадварот, RP11-255P5.3, які адпавядае гену lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, праяўляе спецыфічнасць да тыпу хуткіх валокнаў. Як LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h), так і RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) праяўляюць спецыфічнасць да шкілетных мышцаў (дадатковыя малюнкі 9A–B) і не маюць вядомых скарачальных генаў у сваім геномным асяроддзі памерам 1 Мб, што сведчыць аб тым, што яны адыгрываюць спецыялізаваную ролю ў рэгуляцыі тыпаў валокнаў, а не ў рэгуляцыі суседніх скарачальных генаў. Спецыфічныя профілі экспрэсіі павольных/хуткіх тыпаў валокнаў LINC01405 і RP11-255P5.3 адпаведна былі пацверджаны з дапамогай RNAscope (малюнкі 5B–C).
А. Некадзіруючыя РНК-транскрыпты значна рэгулююцца ў павольных і хуткіх мышачных валокнах. Б. Тыповыя выявы RNAscope, якія паказваюць спецыфічнасць тыпаў павольных і хуткіх мышачных валокнаў LINC01405 і RP11-255P5.3 адпаведна. Маштабная лінейка = 50 мкм. В. Колькасная ацэнка экспрэсіі некадзіруючай РНК, спецыфічнай для тыпу міяфіброў, вызначанай RNAscope (n = 3 біяпсіі ад незалежных асоб, параўнанне хуткіх і павольных мышачных валокнаў у кожнага асобіна). Статыстычны аналіз быў праведзены з выкарыстаннем двухбаковага t-крытэрыя Стьюдэнта. Рамкавыя дыяграмы паказваюць медыяну і першы і трэці квартылі, прычым вусы паказваюць мінімальныя і максімальныя значэнні. Г. Працоўны працэс ідэнтыфікацыі мікробных бялкоў De novo (створаны з дапамогай BioRender.com). Д. Мікробны бялок LINC01405_ORF408:17441:17358 спецыфічна экспрэсуецца ў павольных шкілетных мышачных валокнах (n = 5 біяпсій ад незалежных удзельнікаў, параўнанне хуткіх і павольных мышачных валокнаў у кожнага ўдзельніка). Статыстычны аналіз быў праведзены з выкарыстаннем метаду лінейнай мадэлі Ліма ў спалучэнні з эмпірычным байесаўскім падыходам, а затым метаду Бенджаміні-Хохберга для множных параўнанняў з карэкціроўкай p-значэння. Рамкавыя дыяграмы паказваюць медыяну, першы і трэці квартылі, прычым «вусы» паказваюць максімальныя/мінімальныя значэнні.
Нядаўнія даследаванні паказалі, што многія меркаваныя некадзіруючыя транскрыпты кадуюць транскрыбаваныя мікробныя бялкі, некаторыя з якіх рэгулююць функцыю цягліц.44, 55 Каб ідэнтыфікаваць мікробныя бялкі з патэнцыйнай спецыфічнасцю да тыпу валокнаў, мы прааналізавалі наш набор дадзеных пратэома з 1000 валокнаў, выкарыстоўваючы карыстальніцкі файл FASTA, які змяшчае паслядоўнасці некадзіруючых транскрыптаў (n = 305), знойдзеных у наборы дадзеных транскрыптома з 1000 валокнаў (малюнак 5D). Мы ідэнтыфікавалі 197 мікробных бялкоў з 22 розных транскрыптаў, 71 з якіх дыферэнцыяльна рэгуляваліся паміж павольнымі і хуткімі валокнамі шкілетных цягліц (дадатковы малюнак 9C і дадатковы набор дадзеных 16). Для LINC01405 былі ідэнтыфікаваны тры прадукты мікробных бялкоў, адзін з якіх прадэманстраваў падобную спецыфічнасць да павольных валокнаў, што і яго транскрыпт (малюнак 5E і дадатковы малюнак 9D). Такім чынам, мы ідэнтыфікавалі LINC01405 як ген, які кадуе мікробны бялок, спецыфічны для павольных валокнаў шкілетных цягліц.
Мы распрацавалі комплексны працоўны працэс для маштабнай пратэомнай характарыстыкі асобных цягліцавых валокнаў і вызначылі рэгулятары гетэрагеннасці валокнаў у здаровых станах. Мы ўжылі гэты працоўны працэс, каб зразумець, як немалінавыя міяпатыі ўплываюць на гетэрагеннасць валокнаў шкілетных цягліц. Немалінавыя міяпатыі - гэта спадчынныя захворванні цягліц, якія выклікаюць цягліцавую слабасць і ў дзяцей, якія пакутуюць ад іх, праяўляюцца з шэрагам ускладненняў, у тым ліку рэспіраторным дыстрэсам, скаліёзам і абмежаванай рухомасцю канечнасцяў.19,20 Як правіла, пры немалінавых міяпатыях патагенныя варыянты ў такіх генах, як актын альфа 1 (ACTA1), прыводзяць да перавагі складу міяфібрын павольных валокнаў, хоць гэты эфект неаднародны. Адным з прыкметных выключэнняў з'яўляецца тропанін Т1 немалінавая міяпатыя (TNNT1), у якой пераважаюць хуткія валокны. Такім чынам, лепшае разуменне гетэрагеннасці, якая ляжыць у аснове парушэння рэгуляцыі валокнаў шкілетных цягліц, якое назіраецца пры немалінавых міяпатыях, можа дапамагчы разабрацца ў складаных узаемасувязях паміж гэтымі захворваннямі і тыпам міяфібрын.
У параўнанні са здаровымі кантрольнымі групамі (n=3 на групу), міявалакна, выдзеленыя ад пацыентаў з немалінавай міяпатыяй з мутацыямі ў генах ACTA1 і TNNT1, прадэманстравалі выяўленую атрафію або дыстрафію міявалакн (малюнак 6А, дадатковая табліца 3). Гэта стварала значныя тэхнічныя праблемы для пратэомнага аналізу з-за абмежаванай колькасці даступнага матэрыялу. Нягледзячы на гэта, нам удалося выявіць 2485 бялкоў у 272 шкілетных міявалакнах. Пасля фільтрацыі як мінімум 1000 колькасна вызначаных бялкоў на валакно, 250 валокнаў былі падвергнуты наступнаму біяінфарматычнаму аналізу. Пасля фільтрацыі было колькасна вызначана ў сярэднім 1573 ± 359 бялкоў на валакно (дадатковы малюнак 10А, дадатковыя наборы дадзеных 17–18). Прыкметна, што, нягледзячы на значнае памяншэнне памеру валокнаў, глыбіня пратэома ўзораў пацыентаў з немалінавай міяпатыяй была толькі нязначна зменшана. Больш за тое, апрацоўка гэтых дадзеных з выкарыстаннем нашых уласных файлаў FASTA (у тым ліку некадзіруючых транскрыптаў) дазволіла нам ідэнтыфікаваць пяць мікробных бялкоў у шкілетных міявалакнах пацыентаў з немалінавай міяпатыяй (дадатковы набор дадзеных 19). Дынамічны дыяпазон пратэома быў значна шырэйшым, і агульная колькасць бялкоў у кантрольнай групе добра карэлявала з вынікамі папярэдняга аналізу пратэома з 1000 валокнаў (дадатковы малюнак 10B–C).
А. Мікраскапічныя выявы, якія паказваюць атрафію або дыстрафію валокнаў і перавагу розных тыпаў валокнаў на аснове MYH у немалінавых міяпатыях (NM) ACTA1 і TNNT1. Маштабная лінейка = 100 мкм. Каб забяспечыць узнаўляльнасць афарбоўвання ў пацыентаў з ACTA1 і TNNT1, тры біяпсіі пацыентаў былі афарбаваны два-тры разы (чатыры зрэзы на выпадак) перад выбарам рэпрэзентатыўных выяў. B. Прапорцыі тыпаў валокнаў ва ўдзельнікаў на аснове MYH. C. Графік аналізу галоўных кампанент (PCA) шкілетных цягліцавых валокнаў у пацыентаў з немалінавымі міяпатыямі і кантрольнай групы. D. Шкілетныя цягліцавыя валокны пацыентаў з немалінавымі міяпатыямі і кантрольнай групы, праецыраваныя на графік PCA, вызначаны з 1000 прааналізаваных валокнаў на малюнку 2. Напрыклад, вулканічныя графікі, якія параўноўваюць адрозненні паміж удзельнікамі з немалінавымі міяпатыямі ACTA1 і TNNT1 і кантрольнай групай, а таксама паміж удзельнікамі з немалінавымі міяпатыямі ACTA1 і TNNT1. Каляровыя кругі абазначаюць бялкі, якія значна адрозніваліся пры π < 0,05, а цёмныя кропкі абазначаюць бялкі, якія значна адрозніваліся пры FDR < 0,05. Статыстычны аналіз быў праведзены з выкарыстаннем метаду лінейнай мадэлі Лімы і эмпірычных байесаўскіх метадаў, а затым карэкціроўкі p-значэння для множных параўнанняў з выкарыстаннем метаду Бенджаміні-Хохберга. H. Аналіз узбагачэння значна дыферэнцыяльна экспрэсаваных бялкоў па ўсім пратэоме і ў валокнах тыпу 1 і 2A. Статыстычны аналіз быў праведзены з выкарыстаннем пакета clusterProfiler і скарэкціраваных p-значэнняў Бенджаміні-Хохберга. I, J. Графікі аналізу галоўных кампанент (PCA), афарбаваныя тэрмінамі пазаклеткавага матрыкса і мітахандрыяльнай геннай анталогіі (GO).
Паколькі немалінавыя міяпатыі могуць уплываць на долю тыпаў міяфібр, якія экспрэсуюць MYH, у шкілетных мышцах,19,20 мы спачатку даследавалі тыпы міяфібр, якія экспрэсуюць MYH, у пацыентаў з немалінавымі міяпатыямі і кантрольнай групы. Мы вызначылі тып міяфібр з выкарыстаннем непрадузятага метаду, апісанага раней для аналізу 1000 міяфібр (дадатковыя малюнкі 10D–E), і зноў не змаглі ідэнтыфікаваць чыстыя 2X міяфібр (малюнак 6B). Мы назіралі неаднародны ўплыў немалінавых міяпатый на тып міяфібр, паколькі ў двух пацыентаў з мутацыямі ACTA1 была павялічаная доля міяфібр 1 тыпу, тады як у двух пацыентаў з немалінавай міяпатыяй TNNT1 была паменшаная доля міяфібр 1 тыпу (малюнак 6B). І сапраўды, экспрэсія MYH2 і ізаформ хуткіх трапанінаў (TNNC2, TNNI2 і TNNT3) была зніжана пры міяпатыях ACTA1-немалінавай прыроды, тады як экспрэсія MYH7 была зніжана пры міяпатыях TNNT1-немалінавай прыроды (Дадатковы малюнак 11A). Гэта адпавядае папярэднім паведамленням аб гетэрагенным пераключэнні тыпаў міяфібраў пры міяпатыях немалінавай прыроды.19,20 Мы пацвердзілі гэтыя вынікі імунагістахімічным аналізам і выявілі, што ў пацыентаў з міяпатыяй ACTA1-немалінавай прыроды назіралася перавага міяфібраў 1 тыпу, тады як у пацыентаў з міяпатыяй TNNT1-немалінавай прыроды назіралася супрацьлеглая карціна (Малюнак 6A).
На ўзроўні пратэома аднаго валакна валокны шкілетных цягліц ад пацыентаў з немалінавай міяпатыяй ACTA1 і TNNT1 кластарызаваліся з большасцю кантрольных валокнаў, прычым валокны немалінавай міяпатыі TNNT1 звычайна былі найбольш пашкоджаныя (малюнак 6C). Гэта было асабліва відавочна пры пабудове графікаў аналізу галоўных кампанент (PCA) псеўдараздутых валокнаў для кожнага пацыента, прычым пацыенты 2 і 3 з немалінавай міяпатыяй TNNT1 выглядалі найбольш аддаленымі ад кантрольных узораў (дадатковы малюнак 11B, дадатковы набор дадзеных 20). Каб лепш зразумець, як валокны ад пацыентаў з міяпатыяй параўноўваюцца са здаровымі валокнамі, мы выкарысталі падрабязную інфармацыю, атрыманую з пратэомнага аналізу 1000 валокнаў ад здаровых дарослых удзельнікаў. Мы спраектавалі валокны з набору дадзеных па міяпатыі (пацыенты з немалінавай міяпатыяй ACTA1 і TNNT1 і кантрольная група) на графік PCA, атрыманы з пратэомнага аналізу 1000 валокнаў (малюнак 6D). Размеркаванне тыпаў валокнаў MYH уздоўж PC2 у кантрольных валокнах было падобнае да размеркавання валокнаў, атрыманага з пратэомнага аналізу 1000 валокнаў. Аднак большасць валокнаў у пацыентаў з немалінавай міяпатыяй зрушыліся ўніз па PC2, перакрываючыся са здаровымі хуткаскарачальнымі валокнамі, незалежна ад іх натыўнага тыпу валокнаў MYH. Такім чынам, хоць у пацыентаў з немалінавай міяпатыяй ACTA1 назіраўся зрух у бок валокнаў тыпу 1 пры колькасным вызначэнні з выкарыстаннем метадаў на аснове MYH, як немалінавая міяпатыя ACTA1, так і немалінавая міяпатыя TNNT1 зрушылі пратэом валокнаў шкілетных цягліц у бок хуткаскарачальных валокнаў.
Затым мы непасрэдна параўналі кожную групу пацыентаў са здаровымі кантрольнымі групамі і вызначылі 256 і 552 дыферэнцыяльна экспрэсаваныя бялкі пры немалінавых міяпатыях ACTA1 і TNNT1 адпаведна (малюнак 6E–G і дадатковы малюнак 11C, дадатковы набор дадзеных 21). Аналіз узбагачэння генаў выявіў каардынаванае зніжэнне колькасці мітахондрыяльных бялкоў (малюнак 6H–I, дадатковы набор дадзеных 22). Дзіўна, але, нягледзячы на дыферэнцыяльнае перавага тыпаў валокнаў пры немалінавых міяпатыях ACTA1 і TNNT1, гэта зніжэнне было цалкам незалежным ад тыпу валокнаў на аснове MYH (малюнак 6H і дадатковыя малюнкі 11D–I, дадатковы набор дадзеных 23). Тры мікробныя бялкі таксама рэгуляваліся пры немалінавых міяпатыях ACTA1 або TNNT1. Два з гэтых мікрабялкоў, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (таксама вядомы як LINC00598 або Lnc-FOXO1) і ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), прадэманстравалі розную колькасць толькі ў міявалакнах тыпу 1. Раней паведамлялася, што ENSG00000215483_TR14_ORF67 гуляе ролю ў рэгуляцыі клеткавага цыклу.56 З іншага боку, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (які адпавядае LINC01798) быў павялічаны ў міявалакнах як тыпу 1, так і тыпу 2A пры ACTA1-немалінавай міяпатыі ў параўнанні са здаровымі кантрольнымі групамі (Дадатковы малюнак 12A, Дадатковы набор дадзеных 24). У адрозненне ад гэтага, рыбасомныя бялкі ў значнай ступені не закрануліся немалінавай міяпатыяй, хоць RPS17 быў паніжаны пры немалінавай міяпатыі ACTA1 (мал. 6E).
Аналіз узбагачэння таксама выявіў павышэнне рэгуляцыі працэсаў імуннай сістэмы пры немалінавых міяпатыях ACTA1 і TNNT1, у той час як адгезія клетак таксама павялічвалася пры немалінавай міяпатыі TNNT1 (малюнак 6H). Узбагачэнне гэтых пазаклеткавых фактараў адлюстравалася ў зрушэнні пазаклеткавых матрычных бялкоў PCA ў PC1 і PC2 у адмоўным кірунку (г.зн. у бок найбольш пацярпелых валокнаў) (малюнак 6J). У абедзвюх групах пацыентаў назіралася павышаная экспрэсія пазаклеткавых бялкоў, якія ўдзельнічаюць у імунных рэакцыях і механізмах аднаўлення саркалемы, такіх як анексіны (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 і іх узаемадзейнічаючы бялок S100A1159 (дадатковыя малюнкі 12B–C). Раней паведамлялася, што гэты працэс узмацняецца пры мышачных дыстрафіях60, але, наколькі нам вядома, раней не быў звязаны з немалінавымі міяпатыямі. Нармальная функцыя гэтага малекулярнага апарата неабходная для аднаўлення саркалемы пасля траўмы і для зліцця новаўтвораных міяцытаў з міявалакнамі58,61. Такім чынам, павышаная актыўнасць гэтага працэсу ў абедзвюх групах пацыентаў сведчыць аб рэпаратыўнай рэакцыі на пашкоджанне, выкліканае нестабільнасцю міяфібр.
Эфекты кожнай немалінавай міяпатыі добра карэлявалі (r = 0,736) і прадэманстравалі разумнае перакрыццё (дадатковыя малюнкі 11A–B), што сведчыць аб падобным уздзеянні на пратэом ACTA1 і TNNT1 немалінавай міяпатыі. Аднак некаторыя бялкі рэгуляваліся толькі пры ACTA1 або TNNT1 немалінавай міяпатыі (дадатковыя малюнкі 11A і C). Прафібратычны бялок MFAP4 быў адным з найбольш рэгуляваных бялкоў пры TNNT1 немалінавай міяпатыі, але заставаўся нязменным пры ACTA1 немалінавай міяпатыі. SKIC8, кампанент комплексу PAF1C, які адказвае за рэгуляцыю транскрыпцыі гена HOX, быў рэгуляваны паніжана пры TNNT1 немалінавай міяпатыі, але не змяняўся пры ACTA1 немалінавай міяпатыі (дадатковы малюнак 11A). Прамое параўнанне немалінавай міяпатыі ACTA1 і TNNT1 паказала большае зніжэнне ўзроўню мітахондрыяльных бялкоў і павелічэнне ўзроўню бялкоў імуннай сістэмы пры немалінавай міяпатыі TNNT1 (малюнак 6G–H і дадатковыя малюнкі 11C і 11H–I). Гэтыя дадзеныя адпавядаюць большай атрафіі/дыстрафіі, якая назіраецца пры немалінавай міяпатыі TNNT1 у параўнанні з немалінавай міяпатыяй TNNT1 (малюнак 6A), што сведчыць аб тым, што немалінавая міяпатыя TNNT1 уяўляе сабой больш цяжкую форму захворвання.
Каб ацаніць, ці захоўваюцца назіраныя эфекты немалінавай міяпатыі на ўзроўні ўсёй мышцы, мы правялі масавы пратэомны аналіз біяптатаў мышцаў з той жа кагорты пацыентаў з немалінавай міяпатыяй TNNT1 і параўналі іх з кантрольнай групай (n = 3 у групе) (Дадатковы малюнак 13A, Дадатковы набор дадзеных 25). Як і чакалася, кантрольная група была цесна звязана ў аналізе галоўных кампанент, у той час як пацыенты з немалінавай міяпатыяй TNNT1 прадэманстравалі больш высокую міжвыбарачную зменлівасць, падобную да той, што назіралася пры аналізе асобных валокнаў (Дадатковы малюнак 13B). Масавы аналіз узнавіў дыферэнцыяльна экспрэсаваныя бялкі (Дадатковы малюнак 13C, Дадатковы набор дадзеных 26) і біялагічныя працэсы (Дадатковы малюнак 13D, Дадатковы набор дадзеных 27), вылучаныя пры параўнанні асобных валокнаў, але страціў здольнасць адрозніваць розныя тыпы валокнаў і не змог улічыць гетэрагенныя эфекты захворвання па валокнах.
Узятыя разам, гэтыя дадзеныя паказваюць, што пратэоміка асобных міяфібр можа высветліць клінічныя біялагічныя асаблівасці, якія немагчыма выявіць мэтанакіраванымі метадамі, такімі як імунаблотынг. Больш за тое, гэтыя дадзеныя падкрэсліваюць абмежаванні выкарыстання толькі тыпізацыі актынавых валокнаў (MYH) для апісання фенатыпічнай адаптацыі. Сапраўды, хоць пераключэнне тыпаў валокнаў адрозніваецца пры актынавых і трапанінавых немалінавых міяпатыях, абедзве немалінавыя міяпатыі аддзяляюць тыпізацыю валокнаў MYH ад метабалізму валокнаў шкілетных цягліц у бок больш хуткага і менш акісляльнага мышачнага пратэома.
Клетачная гетэрагеннасць мае вырашальнае значэнне для задавальнення разнастайных патрэб тканак. У шкілетных мышцах гэта часта апісваецца як тыпы валокнаў, якія характарызуюцца рознай ступенню выпрацоўкі сілы і стомленасці. Аднак відавочна, што гэта тлумачыць толькі невялікую частку зменлівасці валокнаў шкілетных мышцаў, якая значна больш зменлівая, складаная і шматгранная, чым лічылася раней. Тэхналагічны прагрэс цяпер праліў святло на фактары, якія рэгулююць валокны шкілетных мышцаў. Сапраўды, нашы дадзеныя сведчаць аб тым, што валокны тыпу 2X могуць не быць асобным падтыпам валокнаў шкілетных мышцаў. Больш за тое, мы вызначылі метабалічныя вавёркі, рыбасомныя вавёркі і клетачна-асацыяваныя вавёркі як асноўныя дэтэрмінанты гетэрагеннасці валокнаў шкілетных мышцаў. Ужываючы наш пратэомны працоўны працэс да ўзораў пацыентаў з нематоднай міяпатыяй, мы дадаткова паказалі, што тыпізацыя валокнаў на аснове MYH не цалкам адлюстроўвае гетэрагеннасць шкілетных мышцаў, асабліва калі сістэма парушаная. Сапраўды, незалежна ад тыпу валокнаў на аснове MYH, нематодная міяпатыя прыводзіць да зруху ў бок больш хуткіх і менш акісляльных валокнаў.
Класіфікацыя валокнаў шкілетных цягліц праводзіцца з XIX стагоддзя. Нядаўнія аналізы метаду омікі дазволілі нам пачаць разумець профілі экспрэсіі розных тыпаў валокнаў MYH і іх рэакцыю на розныя раздражняльнікі. Як апісана тут, падыходы метаду омікі таксама маюць перавагу ў выглядзе большай адчувальнасці для колькаснага вызначэння маркераў тыпу валокнаў у параўнанні з традыцыйнымі метадамі на аснове антыцелаў, без неабходнасці абапірацца на колькаснае вызначэнне аднаго (ці некалькіх) маркераў для вызначэння тыпу валокнаў шкілетных цягліц. Мы выкарысталі дадатковыя транскрыптомныя і пратэомныя працоўныя працэсы і аб'ядналі вынікі, каб вывучыць транскрыпцыйную і посттранскрыпцыйную рэгуляцыю гетэрагеннасці валокнаў у валокнах шкілетных цягліц чалавека. Гэты працоўны працэс прывёў да немагчымасці ідэнтыфікаваць чыстыя валокны тыпу 2X на ўзроўні бялку ў латэральнай шырокай мышцы галавы нашай кагорты здаровых маладых мужчын. Гэта адпавядае папярэднім даследаванням асобных валокнаў, у якіх было выяўлена <1% чыстых валокнаў 2X у здаровых латэральных шырокіх цягліцах, хоць гэта павінна быць пацверджана ў іншых цягліцах у будучыні. Разыходжанне паміж выяўленнем амаль чыстых валокнаў 2X на ўзроўні мРНК і толькі змешаных валокнаў 2A/2X на ўзроўні бялку выклікае здзіўленне. Экспрэсія мРНК ізаформы MYH не з'яўляецца цыркаднай,67 што сведчыць аб тым, што мы наўрад ці «прапусцілі» сігнал пачатку MYH2 у, здавалася б, чыстых валокнах 2X на ўзроўні РНК. Адным з магчымых тлумачэнняў, хоць і чыста гіпатэтычным, могуць быць адрозненні ў стабільнасці бялку і/або мРНК паміж ізаформамі MYH. Сапраўды, ніводнае хуткае валокна не з'яўляецца на 100% чыстым для любой ізаформы MYH, і незразумела, ці прывядуць узроўні экспрэсіі мРНК MYH1 у дыяпазоне 70–90% да аднолькавай колькасці MYH1 і MYH2 на ўзроўні бялку. Аднак, пры разглядзе ўсяго транскрыптома або пратэома, кластарны аналіз можа ўпэўнена ідэнтыфікаваць толькі два розныя кластары, якія прадстаўляюць павольныя і хуткія валокны шкілетных цягліц, незалежна ад іх дакладнага складу MYH. Гэта адпавядае аналізу з выкарыстаннем аднакадравых транскрыптомных падыходаў, якія звычайна ідэнтыфікуюць толькі два розныя міяядзерныя кластары. 68, 69, 70 Акрамя таго, хоць папярэднія пратэомныя даследаванні ідэнтыфікавалі валокны тыпу 2X, гэтыя валокны не кластарызуюцца асобна ад астатніх хуткіх валокнаў і паказваюць толькі невялікую колькасць дыферэнцыяльна распаўсюджаных бялкоў у параўнанні з іншымі тыпамі валокнаў на аснове MYH.14 Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што нам варта вярнуцца да погляду на класіфікацыю цягліцавых валокнаў пачатку 20-га стагоддзя, які падзяляў валокны шкілетных цягліц чалавека не на тры розныя класы на аснове MYH, а на два кластары на аснове іх метабалічных і скарачальных уласцівасцей.63
Што яшчэ больш важна, гетэрагеннасць міяфібрын варта разглядаць у некалькіх аспектах. Папярэднія даследаванні «омікі» паказвалі ў гэтым кірунку, мяркуючы, што валокны шкілетных цягліц не ўтвараюць асобных кластараў, а размешчаны ўздоўж кантынууму. 11, 13, 14, 64, 71 Тут мы паказваем, што, акрамя адрозненняў у скарачальных і метабалічных уласцівасцях шкілетных цягліц, міяфібрыны можна дыферэнцыяваць па асаблівасцях, звязаных з міжклеткавым узаемадзеяннем і механізмамі трансляцыі. Сапраўды, мы выявілі гетэрагеннасць рыбасом у валокнах шкілетных цягліц, якая спрыяе гетэрагеннасці незалежна ад тыпаў павольных і хуткіх валокнаў. Асноўная прычына гэтай істотнай гетэрагеннасці міяфібрын, незалежна ад тыпу павольных і хуткіх валокнаў, застаецца незразумелай, але яна можа сведчыць аб спецыялізаванай прасторавай арганізацыі ў цягліцавых пучках, якія аптымальна рэагуюць на пэўныя сілы і нагрузкі,72 спецыялізаванай клеткавай або органаспецыфічнай камунікацыі з іншымі тыпамі клетак у мікраасяроддзі цягліц73,74,75 або адрозненнях у актыўнасці рыбасом у асобных міяфібрынах. І сапраўды, было паказана, што рыбасомная гетэраплазмія, альбо праз паралагічнае замяшчэнне RPL3 і RPL3L, альбо на ўзроўні 2'O-метылявання рРНК, звязана з гіпертрафіяй шкілетных мышцаў76,77. Мультымікамп'ютэрнае і прасторавае прымяненне ў спалучэнні з функцыянальнай характарыстыкай асобных міяфібраў дазволіць яшчэ больш пашырыць наша разуменне біялогіі мышцаў на мультымікамп'ютэрным узроўні78.
Аналізуючы пратэомы асобных міявалакнін пацыентаў з немалінавымі міяпатыямі, мы таксама прадэманстравалі карыснасць, эфектыўнасць і прыдатнасць пратэомікі асобных міявалакнін для вывучэння клінічнай патафізіялогіі шкілетных мышцаў. Больш за тое, параўноўваючы наш працоўны працэс з глабальным пратэомным аналізам, мы змаглі паказаць, што пратэоміка асобных міявалакнін дае такую ж глыбіню інфармацыі, як і глабальная тканевая пратэоміка, і пашырае гэтую глыбіню, улічваючы міжвалакновую неаднароднасць і тып міявалакнін. Акрамя чаканых (хоць і зменных) адрозненняў у суадносінах тыпаў валокнаў, якія назіраюцца пры немалінавых міяпатыях ACTA1 і TNNT1 у параўнанні са здаровымі кантрольнымі групамі,19 мы таксама назіралі акісляльнае і пазаклеткавае перабудову, незалежную ад пераключэння тыпаў валокнаў, апасродкаванага MYH. Раней паведамлялася пра фіброз пры немалінавых міяпатыях TNNT1.19 Аднак наш аналіз грунтуецца на гэтай выснове, таксама выяўляючы павышаны ўзровень пазаклеткава сакрэтаваных стрэсавых бялкоў, такіх як анексіны, якія ўдзельнічаюць у механізмах аднаўлення саркалемы, у міявалакнах пацыентаў з немалінавымі міяпатыямі ACTA1 і TNNT1.57,58,59 У заключэнне, павышаны ўзровень анексіну ў міявалакнах пацыентаў з немалінавай міяпатыяй можа адлюстроўваць клеткавую рэакцыю на аднаўленне моцна атрафічных міявалакнін.
Нягледзячы на тое, што гэта даследаванне ўяўляе сабой найбуйнейшы на сённяшні дзень аналіз асобных валокнаў у людзей з выкарыстаннем цэлай мышачнай омікі, яно не пазбаўлена абмежаванняў. Мы вылучылі валокны шкілетных цягліц з адносна невялікай і аднароднай выбаркі ўдзельнікаў і адной мышцы (латэральнай шырокай мышцы цягліц). Такім чынам, немагчыма выключыць існаванне спецыфічных папуляцый валокнаў у розных тыпах цягліц і ў экстрэмальных умовах мышачнай фізіялогіі. Напрыклад, мы не можам выключыць магчымасць узнікнення падмноства звышхуткіх валокнаў (напрыклад, чыстых 2X валокнаў) у высокатрэніраваных спрынтараў і/або сілавых спартсменаў79 або ў перыяды мышачнай бяздзейнасці66,80. Акрамя таго, абмежаваны памер выбаркі ўдзельнікаў перашкодзіў нам даследаваць палавыя адрозненні ў гетэрагеннасці валокнаў, паколькі вядома, што суадносіны тыпаў валокнаў адрозніваюцца ў мужчын і жанчын. Акрамя таго, мы не змаглі правесці транскрыптомны і пратэомны аналізы на тых жа мышачных валокнах або ўзорах ад тых жа ўдзельнікаў. Паколькі мы і іншыя працягваем аптымізаваць аналізы асобных клетак і асобных міяфібраў з выкарыстаннем омік-аналізу для дасягнення звышнізкага ўваходнага аб'ёму пробы (як паказана тут пры аналізе валокнаў пацыентаў з мітахандрыяльнай міяпатыяй), становіцца відавочнай магчымасць спалучэння мультыомік (і функцыянальных) падыходаў у межах асобных цягліцавых валокнаў.
У цэлым, нашы дадзеныя ідэнтыфікуюць і тлумачаць транскрыпцыйныя і посттранскрыпцыйныя фактары гетэрагеннасці шкілетных мышцаў. У прыватнасці, мы прадстаўляем дадзеныя, якія аспрэчваюць даўнюю догму ў фізіялогіі шкілетных мышцаў, звязаную з класічным вызначэннем тыпаў валокнаў на аснове MYH. Мы спадзяемся аднавіць дыскусію і ў рэшце рэшт пераасэнсаваць наша разуменне класіфікацыі і гетэрагеннасці валокнаў шкілетных мышцаў.
Чатырнаццаць удзельнікаў еўрапеоіднай расы (12 мужчын і 2 жанчыны) добраахвотна пагадзіліся прыняць удзел у гэтым даследаванні. Даследаванне было ўхвалена Этычным камітэтам Генцкага ўніверсітэцкага шпіталя (BC-10237), адпавядала Хельсінкскай дэкларацыі 2013 года і зарэгістравана на ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Агульныя характарыстыкі ўдзельнікаў прадстаўлены ў Дадатковай табліцы 1. Пасля атрымання вуснай і пісьмовай інфармаванай згоды ўдзельнікі прайшлі медыцынскі агляд перад канчатковым уключэннем у даследаванне. Удзельнікі былі маладымі (22–42 гады), здаровымі (без захворванняў, без гісторыі курэння) і ўмерана фізічна актыўнымі. Максімальнае спажыванне кіслароду вызначалася з дапамогай стэп-эргаметра для ацэнкі фізічнай падрыхтоўкі, як апісана раней. 81
Узоры біяпсіі цягліц збіраліся тры разы ў стане спакою і нашча з інтэрвалам у 14 дзён. Паколькі гэтыя ўзоры збіраліся ў рамках больш маштабнага даследавання, удзельнікі прымалі плацеба (лактозу), антаганіст H1-рэцэптараў (540 мг фексафенадыну) або антаганіст H2-рэцэптараў (40 мг фаматыдыну) за 40 хвілін да біяпсіі. Раней мы паказалі, што гэтыя антаганісты гістамінавых рэцэптараў не ўплываюць на фізічную форму шкілетных цягліц у стане спакою81, і на нашых графіках кантролю якасці не назіралася кластарызацыі, звязанай са станам (дадатковыя малюнкі 3 і 6). Стандартызаваная дыета (41,4 ккал/кг масы цела, 5,1 г вугляводаў/кг масы цела, 1,4 г бялку/кг масы цела і 1,6 г/кг тлушчу/кг масы цела) падтрымлівалася на працягу 48 гадзін да кожнага эксперыментальнага дня, а стандартызаваны сняданак (1,5 г вугляводаў/кг масы цела) спажываўся раніцай у эксперыментальны дзень. Пад мясцовай анестэзіяй (0,5 мл 1% лідакаіну без адрэналіну) былі атрыманы біяптаты цягліц з латэральнай шырокай мышцы галавы з дапамогай перкутаннай аспірацыі Бергстрэма.82 Узоры цягліц былі неадкладна заліты ў RNAlater і захоўваны пры тэмпературы 4°C да ручной дысекцыі валокнаў (да 3 дзён).
Свежавылучаныя пучкі міяфібр былі перанесены ў свежае асяроддзе RNAlater у культуральнай чашке. Затым асобныя міяфіброўкі былі ўручную рассечаны з дапамогай стэрэамікраскопа і тонкага пінцэта. З кожнага біяптату было выдзелена дваццаць пяць валокнаў, звяртаючы асаблівую ўвагу на выбар валокнаў з розных участкаў біяпсіі. Пасля рассечэння кожнае валакно было акуратна апушчана ў 3 мкл буфера для лізісу (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), які змяшчае ферменты пратэіназы К і ДНКазы, для выдалення непажаданых бялкоў і ДНК. Лізіс клетак і выдаленне бялку/ДНК былі ініцыяваны шляхам кароткага перамешвання на віхравой стужцы, кручэння вадкасці ў мікрацэнтрыфузе і інкубацыі пры пакаёвай тэмпературы (10 хвілін). Затым лізат інкубавалі ў тэрмацыклеры (T100, Bio-Rad) пры тэмпературы 37°C на працягу 5 хвілін, 75°C на працягу 5 хвілін, а затым неадкладна захоўвалі пры тэмпературы -80°C да далейшай апрацоўкі.
Сумяшчальныя з Illumina поліадэніляваныя РНК-бібліятэкі былі падрыхтаваны з 2 мкл лізату міяфібр з выкарыстаннем набору QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Падрабязныя метады можна знайсці ў інструкцыі вытворцы. Працэс пачынаецца з сінтэзу кДНК першага ланцуга шляхам зваротнай транскрыпцыі, падчас якога ўводзяцца унікальныя малекулярныя ідэнтыфікатары (UMI) і спецыфічныя для ўзору штрых-коды i1, каб забяспечыць аб'яднанне ўзораў і паменшыць тэхнічную зменлівасць падчас далейшай апрацоўкі. Затым кДНК з 96 міяфібр аб'ядноўваецца і ачышчаецца з дапамогай магнітных шарыкаў, пасля чаго РНК выдаляецца і праводзіцца сінтэз другога ланцуга з выкарыстаннем выпадковых праймераў. Бібліятэка ачышчаецца з дапамогай магнітных шарыкаў, дадаюцца спецыфічныя для пула меткі i5/i7 і ампліфікуецца з дапамогай ПЦР. На апошнім этапе ачысткі атрымліваюцца сумяшчальныя з Illumina бібліятэкі. Якасць кожнага пула бібліятэк ацэньвалася з выкарыстаннем набору для аналізу ДНК з высокай адчувальнасцю малых фрагментаў (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
На падставе колькаснага вызначэння кубітаў пулы былі дадаткова аб'яднаны ў эквімалярных канцэнтрацыях (2 нМ). Атрыманы пул затым быў секвенаваны на прыборы NovaSeq 6000 у стандартным рэжыме з выкарыстаннем набору рэагентаў NovaSeq S2 (1 × 100 нуклеатыдаў) з загрузкай 2 нМ (4% PhiX).
Наш канвеер заснаваны на канвееры аналізу дадзеных QuantSeq Pool ад Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Спачатку дадзеныя былі дэмультыплексаваны з дапамогай bcl2fastq2 (v2.20.0) на аснове індэкса i7/i5. Затым чытанне 2 было дэмультыплексавана з дапамогай idemux (v0.1.6) на аснове штрых-кода ўзору i1, а паслядоўнасці UMI былі выняты з дапамогай umi_tools (v1.0.1). Затым чытанні былі абрэзаны з дапамогай cutadapt (v3.4) у некалькіх раўндах, каб выдаліць кароткія чытанні (даўжынёй <20) або чытанні, якія складаюцца выключна з адаптарных паслядоўнасцей. Затым чытанні былі выраўнаваны з геномам чалавека з дапамогай STAR (v2.6.0c), а файлы BAM былі індэксаваны з дапамогай SAMtools (v1.11). Дублікаты чытанняў былі выдалены з дапамогай umi_tools (v1.0.1). Нарэшце, падлік выраўноўвання быў выкананы з дапамогай featureCounts у Subread (v2.0.3). Кантроль якасці праводзіўся з выкарыстаннем FastQC (v0.11.9) на некалькіх прамежкавых этапах канвеера.
Уся далейшая апрацоўка і візуалізацыя біяінфарматыкі выконвалася ў R (v4.2.3), у асноўным з выкарыстаннем працоўнага працэсу Seurat (v4.4.0).83 Такім чынам, асобныя значэнні UMI і матрыцы метададзеных былі пераўтвораны ў аб'екты Seurat. Гены, экспрэсаваныя менш чым у 30% усіх валокнаў, былі выдалены. Узоры нізкай якасці былі выдалены на аснове мінімальнага парога ў 1000 значэнняў UMI і 1000 выяўленых генаў. У канчатковым выніку 925 валокнаў прайшлі ўсе этапы фільтрацыі кантролю якасці. Значэнні UMI былі нармалізаваны з выкарыстаннем метаду Seurat SCTransform v2,84 уключаючы ўсе 7418 выяўленых прыкмет, а адрозненні паміж удзельнікамі былі рэгрэсіраваны. Усе адпаведныя метададзеныя можна знайсці ў дадатковым наборы дадзеных 28.
Час публікацыі: 10 верасня 2025 г.