Дзякуй за наведванне Nature.com. Версія браўзэра, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для дасягнення найлепшых вынікаў мы рэкамендуем выкарыстоўваць новы браўзэр (альбо адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). У той жа час, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Стварэнне жывёльных мадэляў мадычных змен (МС) з'яўляецца важнай асновай для вывучэння МС. Пяцьдзесят чатыры белых трусоў Новай Зеландыі былі падзелены на групу фальсіфікацый, групу імплантацыі цягліц (ME Group) і групе імплантацыі пульпозу ядра (NPE Group). У групе NPE межпозвонковы дыск быў падвергнуты антэралатэральным паяснічным хірургічным падыходам, і іголка была выкарыстана для праколу цела пазванкоў L5 каля канцавай пласціны. NP быў выняты з межпозвонковага дыска L1/2 і ўводзіў у яго. Свідруючы адтуліну ў субхандральнай косці. Хірургічныя працэдуры і метады свідравання ў групе імплантацыі цягліц і групоўку фальсіфікацыі былі такімі ж, як і ў групе імплантацыі НП. У групе Me ў адтуліну быў змешчаны кавалак цягліц, а ў групе камерцыйных аперацый нічога не было змешчана ў дзірку. Пасля аперацыі былі праведзены МРТ -сканаванне і малекулярнае біялагічнае выпрабаванне. Сігнал у групе NPE змяніўся, але не было відавочнага змены сігналу ў групе Sham-Operation і групы ME. Гісталагічнае назіранне паказала, што ў месцы імплантацыі назіраецца анамальная праліферацыя тканін, і экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ павялічылася ў групе NPE. Імплантацыя НП у субхандральную косць можа ўтвараць жывёльную мадэль MC.
Змены (MC) - гэта паразы пазванкоў і сумежных касцявога мозгу, бачных на магнітна -рэзананснай тамаграфіі (МРТ). Яны даволі часта сустракаюцца ў асоб з звязанымі з імі сімптомамі1. Шматлікія даследаванні падкрэслілі важнасць МС з -за сувязі з болем у паясніцы (ЛБП) 2,3. De Roos et al.4 і Modic et al.5 незалежна ўпершыню апісалі тры розныя тыпы паталогій субхондральнага сігналу ў касцяным мозгу пазванкоў. Змены модычнага тыпу I з'яўляюцца гіпаінтэнсіўнай паслядоўнасцю, узважанай T1 (T1W) і гіперінтэнсіўнай паслядоўнасцю T2 (T2W). Гэта паражэнне выяўляе расколіны і суседнія сасудзістыя грануляцыйныя тканіны ў касцяным мозгу. Змены Modic II тыпу паказваюць высокі сігнал як на паслядоўнасці T1W, так і ў T2W. У гэтым тыпе паразы можна знайсці знішчэнне канчатковай пласціны, а таксама гісталагічную замену тлушчу суседняга касцявога мозгу. Змены тыпу III тыпу паказваюць нізкі сігнал у паслядоўнасці T1W і T2W. Склератычныя паразы, якія адпавядаюць канцамі, назіраліся6. МС лічыцца паталагічным захворваннем пазваночніка і цесна звязана са шматлікімі дэгенератыўнымі захворваннямі пазваночніка7,8,9.
Улічваючы наяўныя дадзеныя, некалькі даследаванняў далі дэталёвае разуменне этыялогіі і паталагічных механізмаў МС. Альберт і інш. выказаў здагадку, што МС можа быць выклікана кілам DISC8. Ху і інш. прыпісвае MC да цяжкай дэгенерацыі дыска10. KROC прапанаваў канцэпцыю "ўнутранага разрыву дыска", у якой гаворыцца, што паўтаральная траўма дыска можа прывесці да мікратэараў у канчатковай пласціне. Пасля фарміравання расколіны, знішчэнне канчатковай пласціны з дапамогай пульпозу ядра (NP) можа выклікаць аутоіммунный адказ, што яшчэ больш прыводзіць да развіцця MC11. Ma et al. падзяліўся падобным меркаваннем і паведаміў, што Autoimmunity, выкліканы NP, гуляе ключавую ролю ў патагенезе MC12.
Клеткі імуннай сістэмы, асабліва лімфацыты CD4+ T, гуляюць вырашальную ролю ў патагенезе аутоімунітэту13. Нядаўна выяўлены падмноства Th17 вырабляе супрацьзапаленчы цітокін IL-17, спрыяе экспрэсіі хемокіна і стымулюе Т-клеткі ў пашкоджаных органах для атрымання IFN-γ14. Клеткі Th2 таксама гуляюць унікальную ролю ў патагенезе імунных рэакцый. Экспрэсія IL-4 як рэпрэзентатыўнай клеткі Th2 можа прывесці да цяжкіх імунапаталагічных наступстваў15.
Хоць шматлікія клінічныя даследаванні праводзіліся на MC16,17,18,19,20,21,22,23,24, усё яшчэ існуе адсутнасць падыходных эксперыментальных мадэляў жывёл, якія могуць імітаваць працэс МС, які часта сустракаецца ў чалавека і можа быць выкарыстоўваецца для даследавання этыялогіі або новых метадаў лячэння, такіх як мэтавая тэрапія. На сённяшні дзень, як паведамлялася, толькі некалькі жывёльных мадэляў МС вывучаюць асноўныя паталагічныя механізмы.
На падставе аутоіммуннай тэорыі, прапанаванай Альбертам і Ма, гэта даследаванне стварыла простую і ўзнаўляльную мадэль труса MC шляхам аўтатрансплантацыі NP каля прасвідраванага канца пазванкоў. Іншыя мэты - назіраць за гісталагічнымі характарыстыкамі жывёльных мадэляў і ацаніць канкрэтныя механізмы НП пры распрацоўцы МС. З гэтай мэтай мы выкарыстоўваем такія метады, як малекулярная біялогія, МРТ і гісталагічныя даследаванні для вывучэння прагрэсавання МС.
Два трусоў памерлі ад крывацёку падчас аперацыі, а чатыры трусы загінулі падчас анестэзіі падчас МРТ. Астатнія 48 трусоў выжылі і не выяўлялі паводніцкіх і неўралагічных прыкмет пасля аперацыі.
МРТ паказвае, што інтэнсіўнасць сігналу ўбудаванай тканіны ў розных адтулінах адрозніваецца. Інтэнсіўнасць сігналу цела пазванкоў L5 у групе NPE паступова змянялася на 12, 16 і 20 тыдняў пасля ўвядзення (паслядоўнасць T1W паказала нізкі сігнал, а паслядоўнасць T2W паказала змешаны сігнал плюс нізкі сігнал) (мал. 1С), у той час як выступленне МРТ выступае з выступленнямі МРТ З астатніх дзвюх груп убудаваных частак заставаліся адносна стабільнымі за той жа перыяд (мал. 1, б).
(A) Рэпрэзентатыўны паслядоўны МРТ трусінага паяснічнага аддзела пазваночніка ў 3 часовыя кропкі. На малюнках групоўкі Sham-Operation не было выяўлена адхіленняў сігналу. (Б) характарыстыкі сігналу цела пазванкоў у групе ME падобныя на тыя, што ў групе фальсіфікацыі, і на месцы ўбудавання не назіраецца значных зменаў сігналу. (C) У групе NPE нізкі сігнал добра бачны ў паслядоўнасці T1W, а змешаны сігнал і нізкі сігнал добра бачныя ў паслядоўнасці T2W. З 12-тыднёвага перыяду да 20-тыднёвага перыяду спарадычныя сігналы, якія атачаюць нізкія сігналы ў паслядоўнасці T2W, памяншаюцца.
Відавочную гіперплазію косці можна ўбачыць у месцы імплантацыі цела пазванкоў у групе NPE, а гіперплазія касцяной тканіны адбываецца хутчэй ад 12 да 20 тыдняў (мал. 2С) у параўнанні з групай NPE, істотнае змяненне ў мадэляваным пазваночніку не назіраецца ў мадэляваным вяршыні целы; Група Sham і Me (мал. 2С) 2а, б).
(А) Паверхню цела пазванкоў на імплантаванай частцы вельмі гладкая, адтуліна добра гоіцца, і ў целе пазванкоў няма гіперплазіі. (Б) Форма імплантаванага сайта ў групе ME падобная на такую, што ў групе аперацыйнай аперацыі, і няма відавочных змен у з'яўленні імплантаванага сайта з цягам часу. (C) Касцяная гіперплазія адбылася на імплантаванай участку ў групе NPE. Гіперплазія косці хутка павялічвалася і нават пашыралася праз межпозвонковы дыск да кантралатэральнага цела пазванкоў.
Гісталагічны аналіз дае больш падрабязную інфармацыю пра фарміраванне костак. На малюнку 3 прыведзены фатаграфіі пасляаперацыйных раздзелаў, афарбаваных H&E. У групе апантаных аперацый хандрацыты былі добра размешчаны і не было выяўлена праліферацыі клетак (мал. 3а). Сітуацыя ў групе ME была падобная на тое, што ў групе фальсіфікацыі (мал. 3, б). Аднак у групе NPE была адзначана вялікая колькасць хандрацытаў і праліферацыю клетак, падобных на НП, на месцы імплантацыі (мал. 3С);
(A) Трабекулы можна ўбачыць каля канцавой пласціны, хандрацыты акуратна размешчаны з раўнамерным памерам і формай клетак і адсутнасцю праліферацыі (40 разоў). (Б) Умова сайта імплантацыі ў групе ME падобная на такую групу Sham. Трабекулы і хондрацыты можна ўбачыць, але ў месцы імплантацыі няма відавочнай праліферацыі (40 разоў). .
Экспрэсія мРНК інтэрлейкіну 4 (IL-4), мРНК інтэрлейкіну 17 (IL-17) і мРНК інтэрферону γ (IFN-γ) назіралася як у групах NPE, так і ME. Пры параўнанні ўзроўню экспрэсіі генаў мэтавых генаў, экспрэсіі генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ значна павялічыліся ў групе NPE ў параўнанні з групамі групы ME і Sham Group (мал. 4) (Р <0,05). У параўнанні з Sham Group, узровень экспрэсіі IL-4, IL-17 і IFN-γ у групе ME павялічыўся толькі нязначна і не дасягнуў статыстычных змяненняў (P> 0,05).
Экспрэсія мРНК IL-4, IL-17 і IFN-γ у групе NPE паказала значна большую тэндэнцыю, чым у групе аперацыйнай аперацыі і групы ME (P <0,05).
У адрозненне ад гэтага, узровень экспрэсіі ў групе ME не паказаў істотнай розніцы (P> 0,05).
Аналіз Western Blot быў праведзены з выкарыстаннем камерцыйна даступных антыцелаў да IL-4 і IL-17, каб пацвердзіць змененую карціну экспрэсіі мРНК. Як паказана на малюнках 5А, B, у параўнанні з групай ME і Sham Group, узровень бялку IL-4 і IL-17 у групе NPE значна павялічыўся (р <0,05). У параўнанні з групай аперацыйнай аперацыі, узровень бялку IL-4 і IL-17 у групе ME таксама не дасягнуў статыстычна значных змяненняў (P> 0,05).
(A) Узровень бялку IL-4 і IL-17 у групе NPE быў значна вышэйшы, чым у групе ME і плацебо (P <0,05). (Б) Гістаграма Western Blot.
З -за абмежаванай колькасці чалавечых узораў, атрыманых падчас аперацыі, выразныя і дэталёвыя даследаванні патагенезу МС некалькі складаныя. Мы паспрабавалі стварыць жывёльную мадэль МС для вывучэння яго патэнцыйных паталагічных механізмаў. У той жа час для прытрымлівання працэду MC, выкліканага NP AutoGraft, выкарыстоўваліся рэнтгеналагічныя ацэнкі, гісталагічная ацэнка і малекулярная біялагічная ацэнка. У выніку мадэль імплантацыі NP прывяла да паступовага змены інтэнсіўнасці сігналу з 12-тыднёвага да 20-тыднёвага часу (змешаны нізкі сігнал у паслядоўнасцях T1W і нізкі сігнал у паслядоўнасці T2W), што сведчыць пра змены тканін, а таксама гісталагічныя і малекулярныя Біялагічныя ацэнкі пацвердзілі вынікі рэнтгеналагічнага даследавання.
Вынікі гэтага эксперыменту паказваюць, што візуальныя і гісталагічныя змены адбыліся на месцы парушэння цела пазванкоў у групе NPE. У той жа час назіралася экспрэсія генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ, а таксама IL-4, IL-17 і IFN-γ, што сведчыць пра тое, што парушэнне тканіны пульпозу аутологіі ядра ў пазваночніку пазванка Цела можа выклікаць шэраг сігналаў і марфалагічных змен. Лёгка знайсці, што характарыстыкі сігналу пазванкоў целаў жывёльнай мадэлі (нізкі сігнал у паслядоўнасці T1W, змешаны сігнал і нізкі сігнал у паслядоўнасці T2W) вельмі падобныя на характарыстыкі клетак пазванкоў чалавека, а таксама характарыстыкі МРТ таксама Пацвердзіце назіранні за гісталогіяй і грубай анатоміяй, гэта значыць змены клетак цела пазванкоў прагрэсавальныя. Хоць запаленчая рэакцыя, выкліканая вострай траўмай, можа з'явіцца неўзабаве пасля праколу, вынікі МРТ паказалі, што паступова павялічваючы змены сігналу з'явіліся праз 12 тыдняў пасля праколу і захоўваюцца да 20 тыдняў без прыкмет аднаўлення і адмены змяненняў МРТ. Гэтыя вынікі дазваляюць выказаць здагадку, што аўталагічны НП пазванкоў з'яўляецца надзейным метадам стварэння прагрэсавальнага МВ у трусоў.
Гэтая мадэль праколу патрабуе належнага майстэрства, часу і хірургічных намаганняў. У папярэдніх эксперыментах рассяканне або празмерная стымуляцыя паравертебральных звязкаў можа прывесці да фарміравання астэафітаў пазванкоў. Неабходна сачыць, каб не пашкодзіць і раздражняць суседнія дыскі. Паколькі глыбіня пранікнення павінна кантраляваць, каб атрымаць паслядоўныя і ўзнаўляльныя вынікі, мы ўручную зрабілі штэпсель, адключыўшы абалонку іголкі даўжынёй 3 мм. Выкарыстанне гэтай штэкеры забяспечвае раўнамерную глыбіню свідравання ў целе пазванкоў. У папярэдніх эксперыментах тры артапедычныя хірургі, якія ўдзельнічалі ў аперацыі, выявілі, што 16-га калібра іголкі лягчэй працаваць, чым 18-га калібра і іншыя метады. Каб пазбегнуць празмернага крывацёку падчас свідравання, утрыманне іголкі на некаторы час забяспечыць больш прыдатную адтуліну ўстаўкі, што дазваляе выказаць здагадку, што пэўнай ступені МС можна кантраляваць такім чынам.
Хоць шматлікія даследаванні накіраваны на МС, мала вядома пра этыялогію і патагенез MC25,26,27. Зыходзячы з нашых папярэдніх даследаванняў, мы выявілі, што аутоімунітэт гуляе ключавую ролю ў з'яўленні і развіцці MC12. У гэтым даследаванні разглядалася колькасная экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ, якія з'яўляюцца асноўнымі шляхамі дыферэнцыяцыі клетак CD4+ пасля стымуляцыі антыгена. У нашым даследаванні, у параўнанні з негатыўнай групай, група NPE мела больш высокую экспрэсію IL-4, IL-17 і IFN-γ, а ўзровень бялку IL-4 і IL-17 таксама быў вышэйшы.
Клінічна экспрэсія мРНК IL-17 павялічваецца ў клетках НП ад пацыентаў з кілам дыска28. Павышаныя ўзроўні экспрэсіі IL-4 і IFN-γ былі таксама знойдзены ў вострай непрацуючай мадэлі кілы дыска ў параўнанні са здаровым кантролем29. IL-17 гуляе ключавую ролю ў запаленні, пашкоджанні тканін пры аутоіммунных захворваннях30 і ўзмацняе імунны адказ на IFN-γ31. Удасканаленае IL-17-апасродкаванае пашкоджанне тканін у MRL/LPR MICE32 і Autoimmunity Susputible Mice33. IL-4 можа інгібіраваць экспрэсію супрацьзапаленчых цітокіны (напрыклад, IL-1β і TNFα) і актывацыі макрофага34. Паведамлялася, што экспрэсія мРНК IL-4 адрознівалася ў групе NPE ў параўнанні з IL-17 і IFN-γ у той жа момант часу; Экспрэсія мРНК IFN-γ у групе NPE была значна вышэй, чым у іншых групах. Такім чынам, вытворчасць IFN-γ можа стаць медыятарам запаленчай рэакцыі, выкліканай NP Intercalation. Даследаванні паказалі, што IFN-γ выпрацоўваецца некалькімі тыпамі клетак, уключаючы актываваныя Т-клеткі тыпу 1, натуральныя клеткі-забойцы і макрофагі35,36, і з'яўляецца ключавым супрацьзапаленчым цітокінам, які спрыяе імунным рэакцыям37.
Гэта даследаванне дазваляе выказаць здагадку, што аутоіммунны адказ можа ўдзельнічаць у з'яўленні і развіцці МС. Luoma et al. высветлілася, што характарыстыкі сігналу MC і выбітнага NP падобныя на МРТ, і абодва паказваюць высокі сігнал у T2W Sequence38. Было пацверджана, што некаторыя цітокіны былі цесна звязаны з узнікненнем МС, напрыклад, IL-139. Ma et al. выказаў здагадку, што выпінанне ўверх або ўніз НП можа аказаць вялікі ўплыў на ўзнікненне і развіццё MC12. Bobechko40 і Herzbein et al.41 паведамляюць, што NP - гэта імунатолерантная тканіна, якая не можа ўвайсці ў цыркуляцыю сасудаў ад нараджэння. Выступы NP ўводзяць замежныя целы ў кровазабеспячэнне, тым самым апасродкаваўшы мясцовыя аутоіммунныя рэакцыі42. Аўтаімунныя рэакцыі могуць выклікаць вялікую колькасць імунных фактараў, і калі гэтыя фактары пастаянна падвяргаюцца ўздзеянню тканін, яны могуць выклікаць змены ў сігналізацыі43. У гэтым даследаванні празмерная экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ-гэта тыповыя імунныя фактары, што яшчэ больш даказвае цесную сувязь паміж NP і MCS44. Гэтая жывёльная мадэль добра імітуе прарыў і ўваход у канчатковую пласціну. Гэты працэс таксама паказаў уплыў аутоімунітэту на МС.
Як і чакалася, гэтая мадэль жывёл дае нам магчымая платформа для вывучэння МС. Аднак гэтая мадэль па-ранейшаму мае пэўныя абмежаванні: па-першае, падчас фазы назірання за жывёламі некаторыя трусы прамежкавага стадыі павінны быць эўтаназаваны для гісталагічнага і малекулярнага біялогіі, таму некаторыя жывёлы "выпадаюць з часу" з цягам часу. Па -другое, хоць у гэтым даследаванні ўстаноўлены тры часовыя пункты, на жаль, мы змадэлявалі толькі адзін тып MC (змена тыпу I тыпу), таму гэтага недастаткова, каб прадставіць працэс развіцця захворванняў чалавека, і неабходна ўсталяваць больш часовых пунктаў Лепш назіраць усе змены сігналу. Па -трэцяе, змены структуры тканін сапраўды могуць быць выразна паказаны гісталагічным афарбоўваннем, але некаторыя спецыялізаваныя метады могуць лепш выявіць мікраструктурныя змены ў гэтай мадэлі. Напрыклад, палярызаваную светлавую мікраскапію была выкарыстана для аналізу фарміравання фібракартыла ў трусавых межпозвонковых дысках45. Доўгатэрміновае ўздзеянне НП на МС і канчатковую планку патрабуе далейшага вывучэння.
Пяцьдзесят чатыры мужчыны-белыя трусы ў Новай Зеландыі (вага каля 2,5-3 кг, узрост 3-3,5 месяцаў) былі выпадковым чынам падзелены на фальшывую групу аперацый, групу імплантацыі цягліц (ME Group) і групу нервовай імплантацыі (NPE Group). Усе эксперыментальныя працэдуры былі зацверджаны Камітэтам па этыцы бальніцы Цяньцзін, і эксперыментальныя метады былі праведзены ў строгай адпаведнасці з зацверджанымі рэкамендацыямі.
Былі зроблены некаторыя паляпшэнні ў хірургічнай тэхніцы S. Sobajima 46. Кожны трус быў размешчаны ў бакавым становішчы ляжачага, а пярэдняя паверхня пяці паслядоўных паяснічных межпозвонковых дыскаў (ІКА) падвяргалася заднебаковым рэтраператарытаневым падыходам. Кожнаму трусе давалі агульную анестэзію (20% урэтана, 5 мл/кг праз вушную вену). Падоўжны разрэз скуры быў зроблены ад ніжняга краю рэбраў да тазавага краю, 2 см вентральнай да паравертебральных цягліц. Правы антэралатэральны пазваночнік ад L1 да L6 падвяргаўся вострай і тупой рассяканні верхняй падскурнай тканіны, тканіны і рэтраперытане і мышцы (мал. 6А). Узровень дыска вызначаўся пры дапамозе тазавага краю як анатамічнай славутасці для ўзроўню дыска L5-L6. Выкарыстоўвайце іголку для праколу 16 калібраў, каб прасвідраваць адтуліну каля канцавой пласціны пазванка L5 на глыбіню 3 мм (мал. 6, б). Выкарыстоўвайце 5-мл шпрыц, каб аспіраваць пульпоз аўталагічнага ядра ў межпозвонковым дыску L1-L2 (мал. 6С). Выдаліце пульпоз ядра або мышцы ў адпаведнасці з патрабаваннямі кожнай групы. Пасля таго, як свідравая адтуліна паглыбляецца, паглынальныя швы размяшчаюцца на глыбокай фасцыі, павярхоўнай фасцыі і скуры, прымушаючы не пашкодзіць периостеальной тканіны цела пазванкоў падчас аперацыі.
(A) Дыск L5 -L6 падвяргаецца заднетэральным рэтрапертэнеальным падыходам. (Б) Выкарыстоўвайце іголку для 16-га калібра, каб прасвідраваць адтуліну каля канчатковай пласціны L5. (C) Аўталагічныя MFS збіраюць.
Агульная анестэзія ўводзілася з 20% урэтанам (5 мл/кг), прызначаным праз вушныя вены, а рэнтгенаграмы паяснічнага аддзела пазваночніка паўтараліся ў 12, 16 і 20 тыдняў у пасляаперацыйным перыядзе.
Трусоў ахвяраваў нутрацягліцавым ін'екцыяй кетаміну (25,0 мг/кг) і нутравенным пентобарбіталам натрыю (1,2 г/кг) праз 12, 16 і 20 тыдняў пасля аперацыі. Увесь пазваночнік быў выдалены для гісталагічнага аналізу і быў праведзены рэальны аналіз. Для выяўлення змяненняў у імунных фактарах былі выкарыстаны колькасную зваротную транскрыпцыю (RT-QPCR) і вестэрн-блотынг.
МРТ -экзамены праводзіліся ў трусоў з выкарыстаннем 3,0 T клінічнага магніта (GE Medical Systems, Florence, SC), абсталяванай артаганальнай канечнай шпулькай. Трусні былі абязболены 20% урэтанам (5 мл/кг) праз вушную вену, а затым размясцілі лежачы ў магніт з паяснічнай вобласцю, арыентаванай на круглую павярхоўную шпульку дыяметрам 5-цалевага (GE Medical Systems). Каранальны T2-узважаны лакалізатар выявы (TR, 1445 мс; TE, 37 мс) былі набыты для вызначэння размяшчэння паяснічнага дыска ад L3-L4 да L5-L6. Старытальныя плоскасці T2-узважаныя зрэзы былі набыты з наступнымі наладамі: Хуткая паслядоўнасць спіна-рэха з часам паўтарэння (TR) 2200 мс і час рэха (TE) 70 мс, матрыца; Візуальнае поле 260 і восем раздражняльнікаў; Таўшчыня рэзкі склала 2 мм, зазор быў 0,2 мм.
Пасля таго, як была зроблена апошняя фатаграфія, і апошні трус быў забіты, на гісталагічным абследаванні былі выдалены ганьбы, убудаваныя цягліцы і дыскі НП. Тканіны фіксуюць у 10% нейтральным буферным фармаліне на працягу 1 тыдня, дэкальцыфікаваны этилендиаминетроцецической кіслатой і парафінам. Тканкавыя блокі былі ўбудаваны ў парафін і разразаныя на сагітальныя ўчасткі (таўшчынёй 5 мкм) пры дапамозе мікратома. Зрэзы афарбоўвалі гематаксілінам і эозінам (H&E).
Пасля збору межпозвонковых дыскаў з трусоў у кожнай групе, агульная РНК была здабыта з дапамогай калонкі UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Кітай) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы і імправізаванай сістэмай зваротнай транскрыпцыі II (Promega Inc. , Мэдысан, WI, ЗША). Была праведзена зваротная транскрыпцыя.
RT-QPCR праводзіўся з выкарыстаннем Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ЗША) і Sybr Green Jump Start Taq Deyymix (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, ЗША) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Аб'ём рэакцыі ПЦР склаў 20 мкл і ўтрымліваў 1,5 мкл разведзенай кДНК і 0,2 мкМ кожнага праймера. Праймеры былі распрацаваны Oligoperfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) і выраблена кампаніяй Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Кітай) (табліца 1). Былі выкарыстаны наступныя цеплавыя веласіпедныя ўмовы: пачатковая стадыя актывацыі палімеразы пры 94 ° С на працягу 2 мін, затым 40 цыклаў 15 с кожны пры 94 ° С для дэнатурацыі шаблона, адпалу на працягу 1 мін пры 60 ° С, пашырэнні і флуарэсцэнцыі. Вымярэнні праводзілі на працягу 1 мін пры 72 ° С. Усе ўзоры былі ўзмоцнены тры разы, а сярэдняе значэнне было выкарыстана для аналізу RT-QPCR. Дадзеныя аб ампліфікацыі былі прааналізаваны пры дапамозе FlexTation 3 (малекулярныя прылады, Sunnyvale, Каліфорнія, ЗША). Экспрэсія генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ была нармалізавана да эндагеннага кантролю (ACTB). Адносныя ўзроўні экспрэсіі мРНК-мэты разлічваліся з выкарыстаннем метаду 2-δct.
Агульны бялок быў экстрагаваны з тканін пры дапамозе тканкавага гомагенізатара ў буферы лізісу RIPA (які змяшчае кактэйль з протеазай і інгібітарам фасфатазы), а затым центрифугируют пры 13000 абаротаў на працягу 20 мін пры 4 ° С, каб выдаліць смецце тканіны. Пяцьдзесят мікраграмаў бялку былі загружаныя на паласу, падзеленыя на 10% SDS-PAGE, а затым пераносіліся на мембрану PVDF. Блакіроўка праводзілася ў 5% сухога малака ў нятлустым колеры ў фізіялагічным растворы (TBS), які змяшчае 0,1% Tween 20 за 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы. Мембрану інкубавалі з першасным антыцелам труса (разведзена 1: 200; Boster, Wuhan, China) (разведзены 1: 200; Bioss, Пекін, Кітай) на працягу ночы пры 4 ° С і ўступіла ў рэакцыю ў другі дзень; з другаснымі антыцеламі (казіны анты-труса імунаглабуліну G пры развядзенні 1: 40 000) у спалучэнні з пероксидазай хрэна (Boster, Wuhan, Кітай) на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы. Сігналы Western Blot былі выяўлены за кошт павелічэння хемілюмінесцэнцыі на хемілюмінесцэнтнай мембране пасля рэнтгенаўскага апрамянення. Для денсітаметрычнага аналізу плямы былі сканаваны і колькасна ацанілі з дапамогай праграмнага забеспячэння BandScan, і вынікі былі выражаны як стаўленне імунарэактыўнасці гена мэтавага да імунарэактыўнасці тубуліну.
Статыстычныя разлікі праводзіліся з выкарыстаннем праграмнага пакета SPSS16.0 (SPSS, ЗША). Дадзеныя, сабраныя падчас даследавання, былі выражаны як сярэдняе ± стандартнае адхіленне (сярэдняе ± SD) і прааналізаваны з выкарыстаннем аднабаковых паўторных мер аналізу дысперсіі (ANOVA) для вызначэння адрозненняў паміж дзвюма групамі. P <0,05 лічыўся статыстычна значным.
Такім чынам, стварэнне жывёльнай мадэлі МС шляхам імплантацыі аутологических НП у цела пазванкоў і выкананне макраанатомічнага назірання, МРТ -аналіз, гісталагічную ацэнку і малекулярны біялагічны аналіз могуць стаць важным інструментам для ацэнкі і разумення механізмаў чалавечага МС і развіцця новага тэрапеўтычнага умяшанні.
Як прывесці гэты артыкул: Han, C. et al. Жывёльная мадэль мадычных змяненняў была ўстаноўлена шляхам імплантацыі пульпозу аўталагічнага ядра ў субхандральную косць паяснічнага аддзела пазваночніка. Sci. Рэсп. 6, 35102: 10.1038/SREP35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., and Boos, N. Магнітна -рэзанансная тамаграфія паяснічнага пазваночніка: распаўсюджанасць кілы дыска і ўтрымання, сцісканне каранёў нервовых, канцавых пласцін і паталогіі і астэааартрыт графікаў у бессімптомнай добраахвотнікаў . хуткасць. Радыялогія 209, 661–666, doi: 10.1148/радыялогія.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS і Leboeuf-EED, K. Modic Changes і іх сувязь з клінічнымі высновамі. Еўрапейскі часопіс пазваночніка: Афіцыйная публікацыя Еўрапейскага таварыства пазваночніка, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі пазваночніка і Еўрапейскага таварыства па даследаваннях шыйкі маткі пазваночніка 15, 1312–1319, DOI: 10.1007/S00586-006-0185-X (2006).
Kuisma, M., et al. Зметныя змены ў паяснічных пазваночных канцах: распаўсюджанасць і сувязь з болямі ў паясніцы і радыкулітам у мужчынскіх работнікаў сярэдняга ўзросту. Пазваночнік 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., and Dalinka, M. MRI касцявога мозгу змяняецца каля канцавой пласціны пры дэгенератыўнай хваробе паяснічнага аддзела пазваночніка. Ajr. Амерыканскі часопіс радыялогіі 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ і Carter, JR Degenerative Disc Discument: Ацэнка змены пазванкоў з МРТ. Радыялогія 166, 193–199, doi: 10.1148/радыялогія.166.1.3336678 (1988).
Modic, Mt, Masaryk, TJ, Ross, JS і Carter, JR Imaging ад дэгенератыўных захворванняў дыскаў. Радыялогія 168, 177–186, doi: 10.1148/радыялогія.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS і інш. Прадказальнікі неовертебральной канчатковай пласціны (моды) змяняюцца ў агульнай папуляцыі. Еўрапейскі часопіс пазваночніка: Афіцыйная публікацыя Еўрапейскага таварыства пазваночніка, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі пазваночніка і Еўрапейскага таварыства па даследаваннях шыйкі маткі пазваночніка, аддзел 19, 129–135, DOI: 10.1007/S00586-009-1184-5 (2010).
Альберт, HB і Mannisch, K. Змены зменаў пасля кілы паяснічнага дыска. Еўрапейскі часопіс пазваночніка: Афіцыйная публікацыя Еўрапейскага таварыства пазваночніка, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі пазваночніка і Еўрапейскага таварыства па даследаваннях шыйнага пазваночніка 16, 977–982, DOI: 10.1007/S00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Aturas, T., Gronblad, M. and Kaapa, E. Змены тыпу I тыпу могуць прадказаць хутка прагрэсавальную дэгенерацыю дыска: 1-гадовае перспектыўнае даследаванне. Еўрапейскі часопіс пазваночніка 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ і вентылятар, SW Змены: магчымыя прычыны і ўклад у дэгенерацыю паяснічнага дыска. Медыцынскія гіпотэзы 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
KROK, HV Унутраны разрыў дыскаў. Праблемы з выпадзеннем дыска на працягу 50 гадоў. Пазваночнік (Phila PA 1976) 11, 650–653 (1986).
Час паведамлення: 13 снежня 2014 г.