Дзякуй за наведванне Nature.com. Версія браўзера, якую вы выкарыстоўваеце, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для дасягнення найлепшых вынікаў мы рэкамендуем выкарыстоўваць навейшы браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы будзем паказваць сайт без стыляў і JavaScript.
Стварэнне жывёл мадэляў мадычных змяненняў (MC) з'яўляецца важнай асновай для вывучэння MC. Пяцьдзесят чатыры новазеландскіх белых труса былі падзелены на групу фіктыўнай аперацыі, групу імплантацыі цягліц (група ME) і групу імплантацыі пульпозного ядра (група NPE). У групе NPE міжпазваночны дыск быў адкрыты з дапамогай пярэднебаковага паяснічнага хірургічнага доступу, і іголка была выкарыстана для праколу цела пазванка L5 каля канцавой пласціны. Шпрыцом здабывалі НЧ з міжпазваночнай дыска L1/2 і ўводзілі ў яго. Свідраванне адтуліны ў субхондральной косткі. Хірургічныя працэдуры і метады свідравання ў групе мышачнай імплантацыі і групе фіктыўнай аперацыі былі такімі ж, як і ў групе імплантацыі NP. У групе ME ў адтуліну змяшчалі кавалачак мышцы, у той час як у групе фіктыўнай аперацыі ў адтуліну нічога не клалі. Пасля аперацыі правялі МРТ і малекулярна-біялагічныя даследаванні. Сігнал у групе NPE змяніўся, але не было відавочнай змены сігналу ў групе фіктыўнай аперацыі і групе ME. Гістологіческое назіранне паказала, што анамальная праліферацыя тканін назіралася ў месцы імплантацыі, а экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ была павялічана ў групе NPE. Імплантацыя NP ў субхондральной косць можа сфармаваць жывёльную мадэль MC.
Мадычныя змены (МС) - гэта пашкоджанні канцавых пласцінак пазванкоў і прылеглага касцявога мозгу, бачныя на магнітна-рэзананснай тамаграфіі (МРТ). Яны даволі часта сустракаюцца ў людзей з спадарожнымі сімптомамі1. Многія даследаванні падкрэсліваюць важнасць MC з-за яго сувязі з болем у паясніцы (LBP)2,3. de Roos et al.4 і Modic et al.5 незалежна адзін ад аднаго ўпершыню апісалі тры розныя тыпы субхондральных сігнальных анамалій у пазваночным касцяным мозгу. Мадычныя змены тыпу I гіпаінтэнсіўныя на Т1-ўзважаных (T1W) паслядоўнасцях і гіперінтэнсіўныя на Т2-ўзважаных (T2W) паслядоўнасцях. Гэта паражэнне выяўляе канчатковыя пласцінкі расколіны і прылеглую сасудзістую грануляционную тканіну ў касцяным мозгу. Мадычныя змены тыпу II дэманструюць высокі сігнал на паслядоўнасцях T1W і T2W. Пры гэтым тыпе паразы можна выявіць дэструкцыю канцавой пласцінкі, а таксама гістологіческое тлушчавае замяшчэнне прылеглага касцявога мозгу. Мадычныя змены тыпу III паказваюць нізкі сігнал у паслядоўнасцях T1W і T2W. Назіраліся склератычныя паразы, якія адпавядаюць канцавым пласцінкам6. МК лічыцца паталагічным захворваннем пазваночніка і цесна звязаны з многімі дэгенератыўнымі захворваннямі пазваночніка7,8,9.
Улічваючы наяўныя дадзеныя, некалькі даследаванняў далі дэталёвае ўяўленне аб этыялогіі і паталагічных механізмах МК. Альберт і інш. выказаў здагадку, што МК можа быць выкліканы кілай дыска8. Ху і інш. прыпісваюць MC цяжкай дэгенерацыі дыска10. Крок прапанаваў канцэпцыю «ўнутранага разрыву дыска», якая сцвярджае, што паўторныя траўмы дыска могуць прывесці да мікраразрываў канцавой пласціны. Пасля адукацыі шчыліны разбурэнне канцавой пласцінкі пульпозным ядром (NP) можа выклікаць аутоіммунный адказ, які ў далейшым прыводзіць да развіцця MC11. Ма і інш. падзялялі падобнае меркаванне і паведамілі, што NP-індукаваны аутоіммунитет гуляе ключавую ролю ў патагенезе MC12.
Клеткі імуннай сістэмы, асабліва CD4+ Т-лімфацыты-хелперы, гуляюць важную ролю ў патагенезе аутоиммунитета13. Нядаўна адкрытая падмноства Th17 прадукуе провоспалительный цітокіны IL-17, спрыяе экспрэсіі хемокинов і стымулюе Т-клеткі ў пашкоджаных органах выпрацоўваць IFN-γ14. Клеткі Th2 таксама гуляюць унікальную ролю ў патагенезе імунных рэакцый. Экспрэсія IL-4 як рэпрэзентатыўнай клеткі Th2 можа прывесці да цяжкіх иммунопатологических наступстваў15.
Нягледзячы на тое, што на MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 было праведзена шмат клінічных даследаванняў, усё яшчэ не хапае падыходных эксперыментальных мадэляў на жывёл, якія маглі б імітаваць працэс MC, які часта адбываецца ў людзей і можа быць выкарыстоўваецца для даследавання этыялогіі або новых метадаў лячэння, такіх як таргетная тэрапія. На сённяшні дзень паведамлялася, што толькі на некалькіх жывёльных мадэлях MC вывучаюцца асноўныя паталагічныя механізмы.
Грунтуючыся на аутоіммунной тэорыі, прапанаванай Альбертам і Ма, гэта даследаванне ўстанавіла простую і ўзнаўляльную мадэль MC труса шляхам аўтатрансплантацыі NP каля прасвідраванай канцавой пласціны пазванка. Іншыя мэты - назіранне за гістологіческімі характарыстыкамі мадэляў на жывёл і ацэнка спецыфічных механізмаў НП пры развіцці МК. З гэтай мэтай мы выкарыстоўваем такія метады, як малекулярная біялогія, МРТ і гісталагічныя даследаванні для вывучэння прагрэсавання МК.
Два труса памерлі ад крывацёку падчас аперацыі, а чатыры труса памерлі падчас анестэзіі падчас МРТ. Астатнія 48 трусоў выжылі і не паказалі ніякіх паводніцкіх або неўралагічных прыкмет пасля аперацыі.
МРТ паказвае, што інтэнсіўнасць сігналу ўкаранёнай тканіны ў розных адтулінах розная. Інтэнсіўнасць сігналу цела пазванка L5 у групе NPE паступова змянялася праз 12, 16 і 20 тыдняў пасля ўстаўкі (паслядоўнасць T1W паказала нізкі сігнал, а паслядоўнасць T2W паказала змешаны сігнал плюс нізкі сігнал) (мал. 1C), у той час як МРТ дзвюх іншых груп убудаваных частак заставаўся адносна стабільным на працягу таго ж перыяду (мал. 1A, B).
(A) Рэпрэзентатыўная паслядоўная МРТ паяснічнага аддзела хрыбетніка труса ў 3 моманты часу. Ніякіх адхіленняў ад нормы сігналу не было выяўлена на выявах групы фіктыўнай аперацыі. (B) Характарыстыкі сігналу цела пазванка ў групе ME падобныя на характарыстыкі ў групе фіктыўнай аперацыі, і ніякіх істотных змен сігналу не назіраецца ў месцы ўбудавання з цягам часу. (C) У групе NPE нізкі сігнал выразна бачны ў паслядоўнасці T1W, а змешаны сігнал і нізкі сігнал выразна бачныя ў паслядоўнасці T2W. Ад 12-тыднёвага перыяду да 20-тыднёвага перыяду спарадычныя высокія сігналы, навакольныя нізкія сігналы ў паслядоўнасці T2W, памяншаюцца.
Відавочную гіперплазію косткі можна ўбачыць у месцы імплантацыі цела пазванка ў групе NPE, і гіперплазія косткі адбываецца хутчэй ад 12 да 20 тыдняў (мал. 2C) у параўнанні з групай NPE, істотных змен не назіраецца ў мадэляваных пазванках. органы; Фальшывая група і група ME (мал. 2C) 2A, B).
(A) Паверхня цела пазванка ў імплантаваным участку вельмі гладкая, адтуліна добра зарастае, і ў целе пазванка няма гіперплазіі. (B) Форма імплантаванага месца ў групе ME падобная на форму ў групе фіктыўнай аперацыі, і няма відавочных змяненняў у вонкавым выглядзе імплантаванага сайта з цягам часу. (C) Касцяная гіперплазія адбылася на месцы імплантацыі ў групе NPE. Гіперплазія косткі хутка павялічвалася і нават распаўсюджвалася праз міжпазваночны дыск да цела контралатерального пазванка.
Больш падрабязную інфармацыю аб фарміраванні касцяной тканіны дае гісталагічныя аналіз. На малюнку 3 прадстаўлены фатаграфіі пасляаперацыйных зрэзаў, афарбаваных H&E. У групе фіктыўнай аперацыі хандрацыты былі добра размешчаны і праліферацыі клетак выяўлена не было (мал. 3А). Сітуацыя ў групе ME была аналагічная сітуацыі ў групе фіктыўнай аперацыі (мал. 3B). Аднак у групе NPE у месцы імплантацыі назіралася вялікая колькасць хандрацытаў і праліферацыі NP-падобных клетак (мал. 3C);
(A) Трабекулы можна ўбачыць каля канцавой пласціны, хандрацыты акуратна размешчаны з аднолькавым памерам і формай клетак і без праліферацыі (40 разоў). (B) Стан месца імплантацыі ў групе ME падобны на стан фіктыўнай групы. Можна ўбачыць трабекулы і хандрацыты, але відавочнай праліферацыі ў месцы імплантацыі (40 разоў) няма. (B) Можна заўважыць, што хандрацыты і NP-падобныя клеткі значна праліферуюць, а форма і памер хандрацытаў нераўнамерныя (у 40 разоў).
Экспрэсія мРНК інтэрлейкіну 4 (IL-4), мРНК інтэрлейкіну 17 (IL-17) і мРНК інтэрферону γ (IFN-γ) назіралася як у групах NPE, так і ў ME. Калі параўноўвалі ўзроўні экспрэсіі генаў-мішэняў, экспрэсіі генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ былі значна павялічаны ў групе NPE у параўнанні з групай ME і групай фіктыўнай аперацыі (мал. 4). (P <0,05). У параўнанні з групай фіктыўнай аперацыі ўзроўні экспрэсіі IL-4, IL-17 і IFN-γ у групе ME павялічыліся нязначна і не дасягнулі статыстычных змяненняў (P> 0,05).
Экспрэсія мРНК IL-4, IL-17 і IFN-γ у групе NPE паказала значна больш высокую тэндэнцыю, чым у групе фіктыўнай аперацыі і групе ME (P <0,05).
Наадварот, узровень экспрэсіі ў групе ME не выявіў істотнай розніцы (P>0,05).
Вестэрн-блот аналіз праводзіўся з выкарыстаннем камерцыйна даступных антыцелаў супраць IL-4 і IL-17, каб пацвердзіць змененую карціну экспрэсіі мРНК. Як паказана на малюнках 5A, B, у параўнанні з групай ME і групай фіктыўнай аперацыі ўзровень бялку IL-4 і IL-17 у групе NPE быў значна павышаны (P <0,05). У параўнанні з групай фіктыўнай аперацыі ўзровень бялку IL-4 і IL-17 у групе ME таксама не дасягнуў статыстычна значных змен (P> 0,05).
(A) Узроўні бялку IL-4 і IL-17 у групе NPE былі значна вышэй, чым у групе ME і групе плацебо (P <0,05). (B) Вестэрн-блот гістаграма.
З-за абмежаванай колькасці чалавечых узораў, атрыманых падчас аперацыі, дакладныя і падрабязныя даследаванні патагенезу МК некалькі складаныя. Мы паспрабавалі стварыць жывёльную мадэль MC для вывучэння яго патэнцыйных паталагічных механізмаў. У той жа час, рэнтгеналагічная ацэнка, гістологіческая ацэнка і малекулярна-біялагічная ацэнка былі выкарыстаны для прасочвання курсу MC, індукаванага NP аутотрансплантата. У выніку мадэль імплантацыі NP прывяла да паступовага змянення інтэнсіўнасці сігналу ад 12-тыднёвага да 20-тыднёвага перыяду часу (змешаны нізкі сігнал у паслядоўнасцях T1W і нізкі сігнал у паслядоўнасцях T2W), што паказвае на змены ў тканінах, а таксама гісталагічныя і малекулярныя біялагічныя ацэнкі пацвердзілі вынікі радыелагічнага даследавання.
Вынікі гэтага эксперыменту паказваюць, што візуальныя і гісталагічныя змены адбыліся ў месцы ўшчамлення тэл пазванка ў групе NPE. У той жа час назіралася экспрэсія генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ, а таксама IL-4, IL-17 і IFN-γ, што сведчыць аб пашкоджанні аутологичной тканіны пульпозного ядра ў вертэбральным цела можа выклікаць шэраг сігнальных і марфалагічных змен. Лёгка выявіць, што характарыстыкі сігналу тэл пазванкоў жывёльнай мадэлі (нізкі сігнал у паслядоўнасці T1W, змешаны сігнал і нізкі сігнал у паслядоўнасці T2W) вельмі падобныя на характарыстыкі клетак пазванкоў чалавека, і характарыстыкі МРТ таксама пацвярджаюць назіранні гісталогіі і грубай анатоміі, то ёсць змены ў клетках цела пазванка прагрэсіўныя. Нягледзячы на тое, што запаленчая рэакцыя, выкліканая вострай траўмай, можа з'явіцца неўзабаве пасля пункцыі, вынікі МРТ паказалі, што прагрэсіўна нарастаючыя змены сігналу з'яўляюцца праз 12 тыдняў пасля пункцыі і захоўваюцца да 20 тыдняў без якіх-небудзь прыкмет аднаўлення або адмены змяненняў МРТ. Гэтыя вынікі дазваляюць выказаць здагадку, што аутологичная вертэбральны НП з'яўляецца надзейным метадам для ўстанаўлення прагрэсавальнай МВ ў трусоў.
Гэтая мадэль праколу патрабуе адпаведнага майстэрства, часу і хірургічных намаганняў. У папярэдніх эксперыментах рассяканне або празмерная стымуляцыя паравертебральных звязкавых структур можа прывесці да адукацыі остеофитов пазванкоў. Трэба быць асцярожным, каб не пашкодзіць і не раздражніць суседнія дыскі. Паколькі глыбіня пранікнення павінна кантралявацца для атрымання паслядоўных і ўзнаўляемых вынікаў, мы ўручную зрабілі корак, адрэзаўшы абалонку іголкі даўжынёй 3 мм. Выкарыстанне гэтай заглушкі забяспечвае раўнамерную глыбіню свідравання ў целе пазванка. У ходзе папярэдніх эксперыментаў тры хірургі-артапеды, якія ўдзельнічалі ў аперацыі, выявілі, што з іголкамі 16-га калібру лягчэй працаваць, чым з іголкамі 18-га калібра або іншымі метадамі. Каб пазбегнуць празмернага крывацёку падчас свідравання, утрымліваючы іголку нерухома некаторы час, вы атрымаеце больш падыходнае адтуліну для ўвядзення, мяркуючы, што такім чынам можна кантраляваць пэўную ступень МС.
Нягледзячы на тое, што многія даследаванні былі накіраваны на MC, мала што вядома аб этыялогіі і патагенезе MC25,26,27. На аснове нашых папярэдніх даследаванняў мы выявілі, што аутоіммунитет гуляе ключавую ролю ва ўзнікненні і развіцці MC12. У гэтым даследаванні вывучалася колькасная экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ, якія з'яўляюцца асноўнымі шляхамі дыферэнцыяцыі клетак CD4+ пасля стымуляцыі антыгенам. У нашым даследаванні ў параўнанні з адмоўнай групай група NPE мела больш высокую экспрэсію IL-4, IL-17 і IFN-γ, а ўзроўні бялку IL-4 і IL-17 таксама былі вышэй.
Клінічна экспрэсія мРНК IL-17 павялічваецца ў NP-клетках пацыентаў з кілай дыска28. Павышаныя ўзроўні экспрэсіі IL-4 і IFN-γ таксама былі выяўленыя ў вострай мадэлі кілы міжпазваночнай дыска без сціскання ў параўнанні са здаровымі людзьмі29. IL-17 гуляе ключавую ролю ў запаленні, пашкоджанні тканін пры аутоіммунных захворваннях30 і ўзмацняе імунны адказ на IFN-γ31. Паведамляецца аб узмацненні IL-17-апасродкаванага пашкоджання тканін у мышэй MRL/lpr32 і адчувальных да аутоіммунитета мышэй33. IL-4 можа інгібіраваць экспрэсію провоспалительных цітокінаў (такіх як IL-1β і TNFα) і актывацыю макрофагов34. Паведамлялася, што экспрэсія мРНК IL-4 адрознівалася ў групе NPE у параўнанні з IL-17 і IFN-γ у той жа момант часу; Экспрэсія мРНК IFN-γ у групе NPE была значна вышэй, чым у іншых групах. Такім чынам, выпрацоўка IFN-γ можа быць медыятарам запаленчай рэакцыі, выкліканай интеркаляцией NP. Даследаванні паказалі, што IFN-γ выпрацоўваецца рознымі тыпамі клетак, уключаючы актываваныя Т-клеткі-хелперы тыпу 1, натуральныя клеткі-кілеры і макрафагі35,36, і з'яўляецца ключавым провоспалительным цітокінам, які спрыяе імунным рэакцыям37.
Гэта даследаванне сведчыць аб тым, што аутоіммунный адказ можа быць уцягнуты ва ўзнікненне і развіццё МК. Луома і інш. выявілі, што характарыстыкі сігналу MC і прыкметнага NP падобныя на МРТ, і абодва паказваюць высокі сігнал у паслядоўнасці T2W38. Было пацверджана, што некаторыя цітокіны цесна звязаны з узнікненнем MC, напрыклад IL-139. Ма і інш. выказалі здагадку, што пратрузія NP уверх ці ўніз можа мець вялікі ўплыў на ўзнікненне і развіццё MC12. Bobechko40 і Herzbein et al.41 паведамілі, што NP - гэта імунаталерантная тканіна, якая не можа патрапіць у судзінкавае кровазварот ад нараджэння. Выпінання NP ўводзяць іншародныя целы ў кроў, тым самым апасродкуючы мясцовыя аутоіммунные рэакцыі42. Аутоіммунные рэакцыі могуць выклікаць вялікую колькасць імунных фактараў, і калі гэтыя фактары пастаянна падвяргаюцца ўздзеянню тканін, яны могуць выклікаць змены ў сігналізацыі43. У гэтым даследаванні празмерная экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ з'яўляюцца тыповымі імуннымі фактарамі, што дадаткова даказвае цесную сувязь паміж NP і MCs44. Гэтая жывёльная мадэль добра імітуе прарыў NP і ўваходжанне ў канцавую пласціну. Гэты працэс яшчэ больш выявіў уплыў аутоіммунітэту на MC.
Як і чакалася, гэтая жывёльная мадэль дае нам магчымую платформу для вывучэння MC. Тым не менш, гэтая мадэль усё яшчэ мае некаторыя абмежаванні: па-першае, падчас фазы назірання за жывёламі, некаторыя трусы на прамежкавай стадыі павінны быць усыплены для гісталагічныя і малекулярна-біялагічных даследаванняў, таму некаторыя жывёлы з часам «выходзяць з ужытку». Па-другое, нягледзячы на тое, што ў гэтым даследаванні ўстаноўлены тры моманты часу, на жаль, мы змадэлявалі толькі адзін тып MC (змена тыпу I па Модыку), таму гэтага недастаткова для адлюстравання працэсу развіцця хваробы ў чалавека, і трэба ўсталяваць больш кропак часу для лепш назіраць за ўсімі зменамі сігналу. Па-трэцяе, змены ў структуры тканіны сапраўды можна выразна паказаць пры гісталагічныя афарбоўцы, але некаторыя спецыялізаваныя метады могуць лепш выявіць мікраструктурныя змены ў гэтай мадэлі. Напрыклад, мікраскапія ў палярызаваным святле выкарыстоўвалася для аналізу фарміравання фіброзна-храстковай тканіны ў міжхрыбеткавых дысках трусоў45. Доўгатэрміновы ўплыў NP на MC і канцавую пласціну патрабуе далейшага вывучэння.
Пяцьдзесят чатыры самца новазеландскіх белых трусоў (вага каля 2,5-3 кг, узрост 3-3,5 месяца) былі выпадковым чынам падзелены на групу фіктыўнай аперацыі, групу мышачнай імплантацыі (група ME) і групу імплантацыі нервовага карэньчыка (група NPE). Усе эксперыментальныя працэдуры былі адобраны Камітэтам па этыцы Цяньцзіньскай бальніцы, і эксперыментальныя метады праводзіліся ў строгай адпаведнасці з зацверджанымі рэкамендацыямі.
Некаторыя ўдасканаленні былі ўнесены ў хірургічную тэхніку S. Sobajima 46 . Кожнага труса клалі ў становішча лежачы на баку, і пярэднюю паверхню пяці паслядоўных паяснічных межпозвоночных дыскаў (МПД) выкрывалі з дапамогай заднебоковой забрюшинного доступу. Кожнаму трусу ўводзілі агульны наркоз (20% урэтан, 5 мл/кг праз вушную вену). Зроблены падоўжны разрэз скуры ад ніжняга краю рэбраў да краю таза, на 2 см вентральней паравертебральном цягліц. Правы переднебоковой аддзел пазваночніка ад L1 да L6 быў выкрыты шляхам вострага і тупога рассякання вышэйлеглай падскурнай клятчаткі, забрюшинной клятчаткі і цягліц (мал. 6А). Узровень дыска вызначалі з выкарыстаннем краю таза ў якасці анатамічнага арыенціра для ўзроўню дыска L5-L6. Выкарыстоўвайце пункціонную іголку 16-га калібру, каб прасвідраваць адтуліну каля канцавой пласціны пазванка L5 на глыбіню 3 мм (мал. 6B). Выкарыстоўвайце 5-мл шпрыц для аспірацыі аутологичного пульпозного ядра ў міжхрыбеткавым дыску L1-L2 (мал. 6C). Выдаліце пульпозное ядро або цягліцу ў адпаведнасці з патрабаваннямі кожнай групы. Пасля паглыблення адтуліны накладваюць рассмоктваюцца швы на глыбокую фасцыю, павярхоўную фасцыю і скуру, сочачы за тым, каб падчас аперацыі не пашкодзіць периостальную тканіна цела пазванка.
(А) Дыск L5-L6 выкрываецца праз заднебоковой забрюшинный доступ. (B) Выкарыстоўвайце іголку 16-га калібру, каб прасвідраваць адтуліну каля кантавой пласціны L5. (C) Аўталагічныя МФ збіраюць.
Агульную анестэзію ўводзілі 20% урэтана (5 мл / кг), уведзеным праз вушную вену, і рэнтгенаграмы паяснічнага аддзела пазваночніка паўтаралі праз 12, 16 і 20 тыдняў пасля аперацыі.
Трусоў забівалі шляхам нутрацягліцавых ін'екцый кетамін (25,0 мг/кг) і пентабарбіталу натрыю (1,2 г/кг) праз 12, 16 і 20 тыдняў пасля аперацыі. Увесь пазваночнік быў выдалены для гісталагічнага аналізу і зроблены рэальны аналіз. Колькасная зваротная транскрыпцыя (RT-qPCR) і вестэрн-блот былі выкарыстаны для выяўлення змяненняў імунных фактараў.
МРТ-даследаванне праводзілі на трусах з выкарыстаннем клінічнага магніта 3,0 Т (GE Medical Systems, Фларэнцыя, Паўднёвая Караліна), абсталяванага прыёмнікам з артаганальнай спіраллю канечнасцяў. Трусоў анестэзіравалі 20% урэтана (5 мл/кг) праз вушную вену, а затым клалі на спіну ўнутр магніта з паяснічнай вобласцю ў цэнтры 5-цалевай шпулькі з круглай паверхняй (GE Medical Systems). Каранальныя Т2-ўзважаныя выявы лакалізатара (TR, 1445 мс; TE, 37 мс) былі атрыманы для вызначэння размяшчэння паяснічнага дыска ад L3-L4 да L5-L6. Т2-ўзважаныя зрэзы сагітальнай плоскасці былі атрыманы з наступнымі параметрамі: хуткая паслядоўнасць спін-рэха з часам паўтарэння (TR) 2200 мс і часам рэха (TE) 70 мс, матрыца; поле зроку 260 і восем стымулаў; Таўшчыня рэзкі 2 мм, зазор 0,2 мм.
Пасля таго, як была зроблена апошняя фатаграфія і быў забіты апошні трус, фіктыўныя, цягліцавыя і NP-дыскі былі выдалены для гісталагічныя даследаванні. Тканіны фіксавалі ў 10% нейтральным забуференном фармаліне на працягу 1 тыдня, декальцинировали этилендиаминтетрауксусной кіслатой і парафінавалі. Тканкавыя блокі залівалі ў парафін і разразалі на сагітальнай зрэзы (таўшчынёй 5 мкм) з дапамогай микротома. Зрэзы афарбоўвалі гематоксилином і эозином (H&E).
Пасля збору міжпазваночных дыскаў у трусоў у кожнай групе агульную РНК экстрагавалі з дапамогай калонкі UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Кітай) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы і сістэмы зваротнай транскрыпцыі ImProm II (Promega Inc. , Мэдысан, Вісконсін, ЗША). Праведзена зваротная транскрыпцыя.
RT-qPCR праводзілі з выкарыстаннем Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ЗША) і SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Аб'ём рэакцыі ПЦР складаў 20 мкл і ўтрымліваў 1,5 мкл разведзенай кДНК і 0,2 мкМ кожнага праймера. Праймеры былі распрацаваны OligoPerfect Designer (Invitrogen, Валенсія, Каліфорнія) і выраблены Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Кітай) (табліца 1). Былі выкарыстаны наступныя ўмовы тэрмічнага цыклу: пачатковая стадыя актывацыі палімеразы пры 94 ° C на працягу 2 хвілін, затым 40 цыклаў па 15 с кожны пры 94 ° C для дэнатурацыі шаблону, адпал на працягу 1 хвіліны пры 60 ° C, пашырэнне і флуарэсцэнцыя. вымярэння праводзілі на працягу 1 хвіліны пры тэмпературы 72 ° С. Усе ўзоры былі ампліфікаваны тройчы, і сярэдняе значэнне выкарыстоўвалася для аналізу RT-qPCR. Дадзеныя па ампліфікацыі былі прааналізаваны з дапамогай FlexStation 3 (Molecular Devices, Санівейл, Каліфорнія, ЗША). Экспрэсію генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ нармалізавалі да эндагеннага кантролю (ACTB). Адносныя ўзроўні экспрэсіі мэтавай мРНК былі разлічаны з дапамогай метаду 2-ΔΔCT.
Агульны бялок экстрагавалі з тканін з дапамогай гомогенизатора тканін у буферы для лізісу RIPA (які змяшчае кактэйль інгібітараў пратэазы і фасфатазы), а затым центрифугировали пры 13000 абаротаў у хвіліну на працягу 20 хвілін пры 4 ° C для выдалення рэшткаў тканіны. Пяцьдзесят мікраграмаў бялку загружалі на дарожку, аддзялялі 10% SDS-PAGE, а затым пераносілі на мембрану PVDF. Блакаванне праводзілі ў 5% абястлушчаным сухім малацэ ў трыс-буферным фізіялагічным растворы (TBS), які змяшчае 0,1% Tween 20, на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы. Мембрану інкубавалі з трусіным першасным антыцелам супраць дэкорыну (разведзеным 1:200; Boster, Ухань, Кітай) (разведзеным 1:200; Bioss, Пекін, Кітай) на працягу ночы пры 4°C і рэагавалі на другія дні; з другаснымі антыцеламі (казіны антытрусіны імунаглабулін G у развядзенні 1:40000) у спалучэнні з пероксидазой хрэна (Boster, Ухань, Кітай) на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы. Сігналы Вестэрн-блот былі выяўлены па ўзмацненні хемилюминесценции на хемилюминесцентной мембране пасля рэнтгенаўскага апрамянення. Для денситометрического аналізу блоты сканавалі і вызначалі колькасна з дапамогай праграмнага забеспячэння BandScan, а вынікі выяўлялі ў выглядзе адносіны імунарэактыўнасці мэтавага гена да імунарэактыўнасці тубуліну.
Статыстычныя разлікі праводзіліся з дапамогай пакета праграм SPSS16.0 (SPSS, ЗША). Дадзеныя, сабраныя падчас даследавання, былі выражаны як сярэдняе ± стандартнае адхіленне (сярэдняе ± стандартнае адхіленне) і прааналізаваны з дапамогай аднабаковага дысперсійнага аналізу паўторных вымярэнняў (ANOVA) для вызначэння адрозненняў паміж дзвюма групамі. Р <0,05 лічылася статыстычна значным.
Такім чынам, стварэнне жывёльнай мадэлі МК шляхам імплантацыі аутологичных НЧ у цела пазванка і выканання макраанатамічнага назірання, аналізу МРТ, гісталагічныя ацэнкі і малекулярна-біялагічнага аналізу можа стаць важным інструментам для ацэнкі і разумення механізмаў МК чалавека і распрацоўкі новых тэрапеўтычных умяшанняў.
Як цытаваць гэты артыкул: Han, C. et al. Жывёльная мадэль змяненняў Модыка была створана шляхам імплантацыі аутологичного пульпозного ядра ў субхондральную косць паяснічнага аддзела хрыбетніка. навук. Рэсп. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J., і Boos, N. Магнітна-рэзанансная тамаграфія паяснічнага аддзела хрыбетніка: распаўсюджанасць кілы дыска і затрымка, здушэнне нервовых карэньчыкаў, анамаліі канцавых пласцін і астэаартоз фасеткавага сустава ў бессімптомных добраахвотнікаў . стаўка. Радыялогія 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, і Leboeuf-Eed, K. Modic змены і іх сувязь з клінічнымі вынікамі. European Spine Journal: афіцыйнае выданне Еўрапейскага таварыства пазваночніка, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі пазваночніка і Еўрапейскага таварыства даследаванняў шыйнага аддзела хрыбетніка 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Куісма М. і інш. Мадычныя змены ў паяснічных пазваночных кантавых пласцінах: распаўсюджанасць і сувязь з болем у паясніцы і радыкулітам у мужчын сярэдняга ўзросту. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., і Dalinka, M. МРТ змяненняў касцявога мозгу каля канцавой пласціны пры дэгенератыўных захворваннях паяснічнага аддзела хрыбетніка. AJR. Амерыканскі часопіс радыялогіі 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Модік, М.Т., Стэйнберг, П.М., Рос, Дж.С., Масарык, Т.Дж., і Картэр, Дж.Р. Дэгенератыўная хвароба дыска: ацэнка змяненняў пазваночнага мозгу з дапамогай МРТ. Радыялогія 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Модік, М.Т., Масарык, Т.Дж., Рос, Дж.С., і Картэр, Дж.Р. Візуалізацыя дэгенератыўнай хваробы дыска. Радыялогія 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS і інш. Прэдыктары неавертэбральнай канцавой пласцінкі (Modic) сігналізуюць аб зменах у агульнай папуляцыі. Еўрапейскі часопіс пазваночніка: Афіцыйнае выданне Еўрапейскага таварыства пазваночніка, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі пазваночніка і Еўрапейскага таварыства даследаванняў шыйнага аддзела хрыбетніка, Аддзел 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB і Mannisch, K. Modic змены пасля кілы паяснічнага дыска. Еўрапейскі часопіс пазваночніка: Афіцыйнае выданне Еўрапейскага таварыства пазваночніка, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі пазваночніка і Еўрапейскага таварыства даследаванняў шыйнага аддзела хрыбетніка 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., і Kaapa, E. Змены тыпу I Modic могуць прадказаць хутка прагрэсавальную дэгенерацыю дэфармацыйнага дыска: 1-гадовае проспективное даследаванне. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ і Fan, SW Змены модыка: магчымыя прычыны і ўклад у дэгенерацыю паяснічнага дыска. Медыцынскія гіпотэзы 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Крок, Х. В. Унутраны разрыў дыска. Праблемы выпадзення дыска старэйшыя за 50 гадоў. Пазваночнік (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Час публікацыі: 13 снежня 2024 г