Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Версія браўзера, якой вы карыстаецеся, мае абмежаваную падтрымку CSS. Для дасягнення найлепшых вынікаў рэкамендуем выкарыстоўваць больш новую версію браўзера (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Тым часам, каб забяспечыць бесперапынную падтрымку, мы будзем адлюстроўваць сайт без стыляў і JavaScript.
Стварэнне жывёльных мадэляў мадыфікаваных змен (MC) з'яўляецца важнай асновай для вывучэння MC. Пяцьдзясят чатыры новазеландскія белыя трусы былі падзелены на групу з імітацыяй аперацыі, групу імплантацыі мышцы (група ME) і групу імплантацыі пульпознага ядра (група NPE). У групе NPE міжпазваночны дыск быў агалены пярэднелатэральным паяснічным хірургічным доступам, і іголка выкарыстоўвалася для праколу цела пазванка L5 каля канцавой пласцінкі. NP быў выняты з міжпазваночнага дыска L1/2 з дапамогай шпрыца і ўведзены ў яго. Свідраванне адтуліны ў субхандральнай костцы. Хірургічныя працэдуры і метады свідравання ў групе імплантацыі мышцы і групе імітацыі аперацыі былі такімі ж, як і ў групе імплантацыі NP. У групе ME ў адтуліну быў змешчаны кавалак мышцы, у той час як у групе імітацыі аперацыі ў адтуліну нічога не змяшчалася. Пасля аперацыі былі праведзены МРТ-сканаванне і малекулярна-біялагічнае тэставанне. Сігнал у групе NPE змяніўся, але відавочных змен сігналу ў групе імітацыі аперацыі і групе ME не было. Гісталагічнае назіранне паказала, што ў месцы імплантацыі назіралася анамальная праліферацыя тканін, а экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ была павялічана ў групе NPE. Імплантацыя NP у субхондральную косць можа ўтварыць жывёльную мадэль MC.
Модычныя змены (МЗ) — гэта паражэнні канцавых пласцінак пазванкоў і прылеглага касцявога мозгу, бачныя на магнітна-рэзананснай тамаграфіі (МРТ). Яны даволі распаўсюджаныя ў людзей з спадарожнымі сімптомамі1. Шматлікія даследаванні падкрэслівалі важнасць МЗ з-за яго сувязі з болем у паясніцы (БП)2,3. дэ Рус і інш.4 і Модык і інш.5 незалежна адзін ад аднаго ўпершыню апісалі тры розныя тыпы субхандральных сігнальных анамалій у касцяным мозгу пазванкоў. Змены тыпу I з'яўляюцца гіпаінтэнсіўнымі на паслядоўнасцях, узважаных па Т1 (Т1В), і гіперінтэнсіўнымі на паслядоўнасцях, узважаных па Т2 (Т2В). Гэта паражэнне выяўляе фісурныя канцавыя пласцінкі і прылеглую грануляцыйную тканіну сасудаў у касцяным мозгу. Змены тыпу II паказваюць высокі сігнал як на паслядоўнасцях T1В, так і на T2В. Пры гэтым тыпе паражэння можна выявіць разбурэнне канцавых пласцінак, а таксама гісталагічнае тлушчавае замяшчэнне прылеглага касцявога мозгу. Змены тыпу III паказваюць нізкі сігнал у паслядоўнасцях T1В і T2В. Назіраліся склератычныя паражэнні, якія адпавядаюць канцавым пласцінкам6. МК лічыцца паталагічным захворваннем хрыбетніка і цесна звязаны з многімі дэгенератыўнымі захворваннямі хрыбетніка7,8,9.
Улічваючы даступныя дадзеныя, некалькі даследаванняў далі падрабязнае разуменне этыялогіі і паталагічных механізмаў развіцця МК. Альберт і інш. выказалі здагадку, што МК можа быць выклікана кілой дыска8. Ху і інш. прыпісвалі МК цяжкай дэгенерацыі дыска10. Крок прапанаваў канцэпцыю «ўнутранага разрыву дыска», згодна з якой паўторныя траўмы дыска могуць прывесці да мікраразрываў канцавой пласцінкі. Пасля ўтварэння шчыліны разбурэнне канцавой пласцінкі пульпазным ядром (НЯ) можа выклікаць аутаімунны адказ, што ў далейшым прыводзіць да развіцця МК11. Ма і інш. падзялілі падобную думку і паведамілі, што аутаімунітэт, выкліканы НЯ, гуляе ключавую ролю ў патагенезе МК12.
Клеткі імуннай сістэмы, асабліва CD4+ Т-хелперныя лімфацыты, адыгрываюць важную ролю ў патагенезе аўтаімунітэту13. Нядаўна выяўленая субпапуляцыя Th17 выпрацоўвае прозапаленчы цытакін IL-17, спрыяе экспрэсіі хемокінаў і стымулюе Т-клеткі ў пашкоджаных органах да выпрацоўкі IFN-γ14. Th2-клеткі таксама адыгрываюць унікальную ролю ў патагенезе імунных рэакцый. Экспрэсія IL-4 як прадстаўніка Th2-клетак можа прывесці да сур'ёзных імунапаталагічнай рэакцыі15.
Нягледзячы на тое, што было праведзена шмат клінічных даследаванняў МК16,17,18,19,20,21,22,23,24, усё яшчэ не хапае прыдатных эксперыментальных мадэляў на жывёлах, якія маглі б імітаваць працэс МК, што часта сустракаецца ў людзей, і якія маглі б быць выкарыстаны для даследавання этыялогіі або новых метадаў лячэння, такіх як таргетная тэрапія. На сённяшні дзень паведамлялася толькі пра некалькі жывёльных мадэляў МК для вывучэння асноўных паталагічных механізмаў.
Зыходзячы з аўтаімуннай тэорыі, прапанаванай Альбертам і Ма, у гэтым даследаванні была створана простая і прайгравальная мадэль рака малочнай залозы труса шляхам аўтатрансплантацыі наначасціц паблізу прасвідраванай канцавой пласцінкі пазванка. Іншыя мэты - назіраць за гісталагічнымі характарыстыкамі жывёльных мадэляў і ацэньваць спецыфічныя механізмы наначасціц у развіцці рака малочнай залозы. З гэтай мэтай мы выкарыстоўваем такія метады, як малекулярная біялогія, МРТ і гісталагічныя даследаванні, для вывучэння прагрэсавання рака малочнай залозы.
Два трусы памерлі ад крывацёку падчас аперацыі, а чатыры трусы памерлі падчас анестэзіі падчас МРТ. Астатнія 48 трусоў выжылі і не праяўлялі ніякіх паводніцкіх або неўралагічных прыкмет пасля аперацыі.
МРТ паказвае, што інтэнсіўнасць сігналу ўбудаванай тканіны ў розныя адтуліны адрозніваецца. Інтэнсіўнасць сігналу цела пазванка L5 у групе NPE паступова змянялася праз 12, 16 і 20 тыдняў пасля ўстаўкі (паслядоўнасць T1W паказвала нізкі сігнал, а паслядоўнасць T2W паказвала змешаны сігнал плюс нізкі сігнал) (мал. 1C), у той час як МРТ-здымкі двух іншых груп убудаваных частак заставаліся адносна стабільнымі на працягу таго ж перыяду (мал. 1A, B).
(A) Тыповыя паслядоўныя МРТ паяснічнага аддзела пазваночніка трусоў у 3 моманты часу. На выявах групы з імітацыяй аперацыі не выяўлена ніякіх анамалій сігналу. (B) Характарыстыкі сігналу цела пазванка ў групе ME падобныя да характарыстык у групе з імітацыяй аперацыі, і істотных змяненняў сігналу ў месцы ўстаўкі з цягам часу не назіраецца. (C) У групе NPE нізкі сігнал выразна бачны ў паслядоўнасці T1W, а змешаны сігнал і нізкі сігнал выразна бачныя ў паслядоўнасці T2W. З 12-тыднёвага перыяду да 20-тыднёвага перыяду спарадычныя высокія сігналы вакол нізкіх сігналаў у паслядоўнасці T2W памяншаюцца.
У групе NPE ў месцы імплантацыі цела пазванка можна ўбачыць відавочную гіперплазію косткі, прычым гіперплазія косткі адбываецца хутчэй, з 12 да 20 тыдняў (мал. 2C), у параўнанні з групай NPE, пры гэтым істотных змен у мадэляваных целах пазванкоў не назіраецца; група «плацебо» і група ME (мал. 2C) 2A,B).
(A) Паверхня цела пазванка ў месцы імплантацыі вельмі гладкая, адтуліна добра гоіцца, і ў целе пазванка няма гіперплазіі. (B) Форма месца імплантацыі ў групе ME падобная да формы ў групе фіктыўнай аперацыі, і няма відавочных змен у знешнім выглядзе месца імплантацыі з цягам часу. (C) У групе NPE ў месцы імплантацыі адбылася гіперплазія касцяной тканкі. Гіперплазія касцяной тканкі хутка павялічвалася і нават распаўсюджвалася праз міжпазваночны дыск на кантралатеральнае цела пазванка.
Гісталагічны аналіз дае больш падрабязную інфармацыю аб фарміраванні касцяной тканкі. На малюнку 3 паказаны фатаграфіі пасляаперацыйных зрэзаў, афарбаваных гемаглабінам і эпітэліяй. У групе з імітацыяй аперацыі хондрацыты былі добра размешчаны, і праліферацыі клетак не выяўлена (мал. 3А). Сітуацыя ў групе ME была падобная да сітуацыі ў групе з імітацыяй аперацыі (мал. 3B). Аднак у групе NPE ў месцы імплантацыі назіралася вялікая колькасць хондрацытаў і праліферацыя NP-падобных клетак (мал. 3C);
(A) Трабекулы можна ўбачыць каля канцавой пласцінкі, хондрацыты акуратна размешчаны з аднастайным памерам і формай клетак і без праліферацыі (40 разоў). (B) Стан месца імплантацыі ў групе ME падобны да стану групы плацебо. Трабекулы і хондрацыты можна ўбачыць, але відавочнай праліферацыі ў месцы імплантацыі няма (40 разоў). (B) Можна бачыць, што хондрацыты і NP-падобныя клеткі значна праліферуюць, а форма і памер хондрацытаў нераўнамерныя (40 разоў).
Экспрэсія мРНК інтэрлейкіну 4 (IL-4), мРНК інтэрлейкіну 17 (IL-17) і мРНК інтэрферону γ (IFN-γ) назіралася ў абедзвюх групах: NPE і ME. Пры параўнанні ўзроўняў экспрэсіі мэтавых генаў экспрэсія генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ была значна павялічана ў групе NPE у параўнанні з групай ME і групай з імітацыяй аперацыі (мал. 4) (P < 0,05). У параўнанні з групай з імітацыяй аперацыі, узроўні экспрэсіі IL-4, IL-17 і IFN-γ у групе ME павялічыліся толькі нязначна і не дасягнулі статыстычных змен (P > 0,05).
Экспрэсія мРНК IL-4, IL-17 і IFN-γ у групе NPE прадэманстравала значна больш высокую тэндэнцыю, чым у групе фіктыўнай аперацыі і групе ME (P < 0,05).
У адрозненне ад гэтага, узроўні экспрэсіі ў групе ME не паказалі істотнай розніцы (P>0,05).
Для пацверджання змененага характару экспрэсіі мРНК быў праведзены вестэрн-блот-аналіз з выкарыстаннем камерцыйна даступных антыцелаў супраць IL-4 і IL-17. Як паказана на малюнках 5A,B, у параўнанні з групай ME і групай з імітацыяй аперацыі, узроўні бялку IL-4 і IL-17 у групе NPE былі значна павялічаны (P < 0,05). У параўнанні з групай з імітацыяй аперацыі, узроўні бялку IL-4 і IL-17 у групе ME таксама не дасягнулі статыстычна значных змен (P > 0,05).
(A) Узровень бялкоў IL-4 і IL-17 у групе NPE быў значна вышэйшым, чым у групе ME і групе плацеба (P < 0,05). (B) Гістаграма вестэрн-блоттынгу.
З-за абмежаванай колькасці ўзораў крыві чалавека, атрыманых падчас аперацыі, правесці выразныя і падрабязныя даследаванні патагенезу МК даволі складана. Мы паспрабавалі стварыць жывёльную мадэль МК, каб вывучыць яго патэнцыйныя паталагічныя механізмы. Адначасова для адсочвання плыні МК, выкліканай аўтатрансплантатам наначасціц, выкарыстоўваліся радыялагічная, гісталагічная і малекулярна-біялагічная ацэнкі. У выніку мадэль імплантацыі наначасціц прывяла да паступовага змянення інтэнсіўнасці сігналу з 12-га да 20-га тыдня (змешаны нізкі сігнал у паслядоўнасцях T1W і нізкі сігнал у паслядоўнасцях T2W), што сведчыць аб зменах у тканінах, і гісталагічная і малекулярна-біялагічная ацэнкі пацвердзілі вынікі радыялагічнага даследавання.
Вынікі гэтага эксперыменту паказваюць, што ў групе NPE адбыліся візуальныя і гісталагічныя змены ў месцы парушэння целаў пазванкоў. У той жа час назіралася экспрэсія генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ, а таксама IL-4, IL-17 і IFN-γ, што сведчыць аб тым, што парушэнне аўталагічнай тканіны пульпазнага ядра ў целе пазванка можа выклікаць шэраг сігнальных і марфалагічных змен. Лёгка выявіць, што сігнальныя характарыстыкі целаў пазванкоў жывёльнай мадэлі (нізкі сігнал у паслядоўнасці T1W, змешаны сігнал і нізкі сігнал у паслядоўнасці T2W) вельмі падобныя да сігнальных характарыстык клетак пазванкоў чалавека, і характарыстыкі МРТ таксама пацвярджаюць назіранні гісталогіі і анатоміі, гэта значыць змены ў клетках целаў пазванкоў прагрэсіўныя. Нягледзячы на тое, што запаленчая рэакцыя, выкліканая вострай траўмай, можа з'явіцца неўзабаве пасля пункцыі, вынікі МРТ паказалі, што прагрэсіўна нарастаючыя змены сігналу з'явіліся праз 12 тыдняў пасля пункцыі і захоўваліся да 20 тыдняў без якіх-небудзь прыкмет аднаўлення або звароту змяненняў МРТ. Гэтыя вынікі сведчаць аб тым, што аўталагічная пазваночная НП з'яўляецца надзейным метадам усталявання прагрэсіўнай мікраваскулярнай вентрыкулярнай пухліны ў трусоў.
Гэтая мадэль праколу патрабуе адэкватных навыкаў, часу і хірургічных намаганняў. У папярэдніх эксперыментах рассяканне або празмерная стымуляцыя паравертебральных звязкавых структур можа прывесці да ўтварэння пазваночных астэафітаў. Трэба быць асцярожным, каб не пашкодзіць і не раздражніць суседнія дыскі. Паколькі глыбіню пранікнення неабходна кантраляваць, каб атрымаць паслядоўныя і прайгравальныя вынікі, мы ўручную зрабілі корак, адрэзаўшы абалонку іголкі даўжынёй 3 мм. Выкарыстанне гэтай корак забяспечвае раўнамерную глыбіню свідравання ў целе пазванка. У папярэдніх эксперыментах тры хірургі-артапеды, якія ўдзельнічалі ў аперацыі, выявілі, што з іголкамі 16-га калібра лягчэй працаваць, чым з іголкамі 18-га калібра або іншымі метадамі. Каб пазбегнуць празмернага крывацёку падчас свідравання, утрыманне іголкі нерухома на працягу некаторага часу забяспечыць больш падыходзячую адтуліну для ўвядзення, што сведчыць аб тым, што такім чынам можна кантраляваць пэўную ступень крывацёку.
Нягледзячы на тое, што шматлікія даследаванні былі накіраваны на вывучэнне МК, мала што вядома пра этыялогію і патагенез МК25,26,27. Зыходзячы з нашых папярэдніх даследаванняў, мы выявілі, што аўтаімунітэт адыгрывае ключавую ролю ва ўзнікненні і развіцці МК12. У гэтым даследаванні вывучалася колькасная экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ, якія з'яўляюцца асноўнымі шляхамі дыферэнцыяцыі клетак CD4+ пасля стымуляцыі антыгенам. У нашым даследаванні, у параўнанні з адмоўнай групай, у групе NPE назіралася больш высокая экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ, а ўзровень бялку IL-4 і IL-17 таксама быў вышэйшым.
Клінічна экспрэсія мРНК IL-17 павышана ў клетках натрыевых мікраарганізмаў (NP) пацыентаў з кілой дыска28. Павышаны ўзровень экспрэсіі IL-4 і IFN-γ таксама быў выяўлены ў мадэлі вострай некампрэсіўнай кілы дыска ў параўнанні са здаровымі кантрольнымі групамі29. IL-17 гуляе ключавую ролю ў запаленні, пашкоджанні тканін пры аўтаімунных захворваннях30 і ўзмацняе імунную рэакцыю на IFN-γ31. Павышанае пашкоджанне тканін, апасродкаванае IL-17, было зарэгістравана ў мышэй MRL/lpr32 і мышэй, адчувальных да аўтаімунітэту33. IL-4 можа інгібіраваць экспрэсію прозапаленчых цытакінаў (такіх як IL-1β і TNFα) і актывацыю макрафагаў34. Паведамлялася, што экспрэсія мРНК IL-4 адрознівалася ў групе NPE у параўнанні з IL-17 і IFN-γ у той жа момант часу; экспрэсія мРНК IFN-γ у групе NPE была значна вышэйшай, чым у іншых групах. Такім чынам, прадукцыя IFN-γ можа быць медыятарам запаленчай рэакцыі, выкліканай інтэркаляцыяй NP. Даследаванні паказалі, што IFN-γ выпрацоўваецца рознымі тыпамі клетак, у тым ліку актываванымі Т-хелперамі 1 тыпу, натуральнымі клеткамі-кілерамі і макрафагамі35,36, і з'яўляецца ключавым прозапаленчым цытакінам, які спрыяе імунным рэакцыям37.
Гэта даследаванне сведчыць аб тым, што аўтаімунны адказ можа быць задзейнічаны ва ўзнікненні і развіцці МК. Луома і інш. выявілі, што сігнальныя характарыстыкі МК і выяўленай НЧ падобныя на МРТ, і абодва дэманструюць высокі сігнал у паслядоўнасці T2W38. Было пацверджана, што некаторыя цытакіны цесна звязаны з узнікненнем МК, такія як IL-139. Ма і інш. выказалі здагадку, што выпінанне НЧ уверх або ўніз можа мець вялікі ўплыў на ўзнікненне і развіццё МК12. Бабечка40 і Херцбайн і інш.41 паведамілі, што НЧ - гэта імунаталерантная тканіна, якая не можа трапіць у сасудзісты кровазварот з нараджэння. Выпінанне НЧ уводзіць іншародныя целы ў кровазварот, тым самым апасродкуючы мясцовыя аўтаімунныя рэакцыі42. Аўтаімунныя рэакцыі могуць выклікаць вялікую колькасць імунных фактараў, і калі гэтыя фактары пастаянна падвяргаюцца ўздзеянню тканін, яны могуць выклікаць змены ў сігналізацыі43. У гэтым даследаванні празмерная экспрэсія IL-4, IL-17 і IFN-γ з'яўляюцца тыповымі імуннымі фактарамі, што дадаткова даказвае цесную сувязь паміж НЧ і МЧ44. Гэтая жывёльная мадэль добра імітуе прарыў НЧ і ўваходжанне ў канцавую пласцінку. Гэты працэс дадаткова паказаў уплыў аўтаімунітэту на МС.
Як і чакалася, гэтая жывёльная мадэль дае нам магчымую платформу для вывучэння храстковай тканіны (МК). Аднак гэтая мадэль усё яшчэ мае некаторыя абмежаванні: па-першае, падчас фазы назірання за жывёламі некаторых трусоў прамежкавай стадыі развіцця неабходна эўтаназіраць для гісталагічных і малекулярна-біялагічных даследаванняў, таму некаторыя жывёлы з часам «выходзяць з ладу». Па-другое, хоць у гэтым даследаванні ўстаноўлены тры часовыя кропкі, на жаль, мы мадэлявалі толькі адзін тып МК (змена тыпу I па Модыку), таму гэтага недастаткова для прадстаўлення працэсу развіцця захворвання ў чалавека, і неабходна ўсталяваць больш часовых кропак, каб лепш назіраць за ўсімі зменамі сігналу. Па-трэцяе, змены ў структуры тканін сапраўды можна выразна паказаць з дапамогай гісталагічнага афарбоўвання, але некаторыя спецыялізаваныя метады могуць лепш выявіць мікраструктурныя змены ў гэтай мадэлі. Напрыклад, для аналізу ўтварэння фіброзна-храстковай тканіны ў міжпазваночных дысках трусоў выкарыстоўвалася палярызаваная светлавая мікраскапія45. Доўгатэрміновыя ўплывы на МК і канцавую пласціну патрабуюць далейшага вывучэння.
Пяцьдзясят чатыры самцы белых новазеландскіх трусоў (вагай каля 2,5-3 кг, узростам 3-3,5 месяца) былі выпадковым чынам падзелены на групу фіктыўнай аперацыі, групу мышачнай імплантацыі (група ME) і групу імплантацыі нервовых карэньчыкаў (група NPE). Усе эксперыментальныя працэдуры былі ўхвалены Этычным камітэтам бальніцы Цяньцзінь, а эксперыментальныя метады праводзіліся ў строгай адпаведнасці з зацверджанымі рэкамендацыямі.
У хірургічную тэхніку С. Собадзімы 46 былі ўнесены некаторыя ўдасканаленні. Кожны трус быў размешчаны ў бакавым становішчы лежачы, і пярэдняя паверхня пяці паслядоўных паяснічных міжпазваночных дыскаў (МПД) была агалена з выкарыстаннем заднябаковага рэтраператальнага доступу. Кожнаму трусу была ўведзена агульная анестэзія (20% урэтан, 5 мл/кг праз вушную вену). Быў зроблены падоўжны разрэз скуры ад ніжняга краю рэбраў да краю таза, на 2 см вентральна да паравертебральных цягліц. Правы пярэднебаковы аддзел пазванка ад L1 да L6 быў агалены шляхам вострага і тупога рассякання падскурнай клятчаткі, рэтраператальнай клятчаткі і цягліц, якія пакрываюць яго (мал. 6А). Узровень дыска вызначаўся з выкарыстаннем краю таза ў якасці анатомічнага арыенціра для ўзроўню дыска L5-L6. Выкарыстоўвайце пункцыйную іголку 16-га калібра, каб прасвідраваць адтуліну каля канцавой пласцінкі пазванка L5 на глыбіню 3 мм (мал. 6В). З дапамогай 5-мілілітровага шпрыца адсмоктвайце аўталагічнае пульпазнае ядро міжпазваночнага дыска L1-L2 (мал. 6C). Выдаляйце пульпазнае ядро або мышцу ў адпаведнасці з патрабаваннямі кожнай групы. Пасля паглыблення адтуліны на глыбокую фасцыю, павярхоўную фасцыю і скуру накладваюць рассмоктвальныя швы, асцярожна, каб не пашкодзіць перыястальную тканіну цела пазванка падчас аперацыі.
(A) Дыск L5–L6 агаляецца праз заднелатэральны рэтраперытанеальны доступ. (B) Выкарыстоўваецца іголка 16-га калібра для прасвідравання адтуліны каля канцавой пласцінкі L5. (C) Забіраюцца аўталагічныя міякарды.
Агульная анестэзія праводзілася 20% урэтанам (5 мл/кг), які ўводзіўся праз вушную вену, а рэнтгенаграфія паяснічнага аддзела хрыбетніка была паўтораная праз 12, 16 і 20 тыдняў пасля аперацыі.
Трусоў забівалі нутрацягліцава кетамінам (25,0 мг/кг) і нутравенна пентабарбіталам натрыю (1,2 г/кг) праз 12, 16 і 20 тыдняў пасля аперацыі. Для гісталагічнага аналізу выдалялі ўвесь хрыбетнік, і праводзілі рэальны аналіз. Для выяўлення змяненняў імунных фактараў выкарыстоўвалі колькасную зваротную транскрыпцыю (RT-qPCR) і вестэрн-блотынг.
МРТ-даследаванні праводзіліся на трусах з выкарыстаннем клінічнага магніта магутнасцю 3,0 Тл (GE Medical Systems, Фларэнс, Паўднёвая Караліна), абсталяванага артаганальным прыёмнікам шпулькі для канечнасцяў. Трусаў анестэзавалі 20% урэтанам (5 мл/кг) праз вушную вену, а затым змяшчалі на спіну ўнутры магніта, цэнтраваўшы паяснічную вобласць на круглай павярхоўнай шпульцы дыяметрам 5 цаляў (GE Medical Systems). Для вызначэння месцазнаходжання паяснічнага дыска ад L3–L4 да L5–L6 былі атрыманы каранарныя Т2-зважаныя лакалізацыйныя выявы (TR, 1445 мс; TE, 37 мс). Сагітальныя плоскасныя Т2-зважаныя зрэзы былі атрыманы з наступнымі наладамі: хуткая спін-эха-паслядоўнасць з часам паўтарэння (TR) 2200 мс і часам рэха (TE) 70 мс, матрыца; поле зроку 260 і восем стымулаў; таўшчыня зрэзу складала 2 мм, шчыліна — 0,2 мм.
Пасля таго, як быў зроблены апошні здымак і забіты апошні трус, фіктыўныя, мышачна-залітыя і натравальныя дыскі былі выдалены для гісталагічнага даследавання. Тканіны фіксавалі ў 10% нейтральным буферным фармаліне на працягу 1 тыдня, дэкальцыфікавалі этылендыамінтэтраацэтавай кіслатой і нарэзалі ў парафіне. Блокі тканін залівалі ў парафін і наразалі на сагітальныя зрэзы (таўшчынёй 5 мкм) з дапамогай мікратома. Зрэзы афарбоўвалі гематаксілінам і эазінам (Г&Э).
Пасля збору міжпазваночных дыскаў у трусоў у кожнай групе, агульную РНК экстрагавалі з выкарыстаннем калонкі UNIQ-10 (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Кітай) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы і сістэмы зваротнай транскрыпцыі ImProm II (Promega Inc., Мэдысан, Вісконсін, ЗША). Была праведзена зваротная транскрыпцыя.
ПЦР у рэальным часе (RT-qPCR) праводзілі з выкарыстаннем Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ЗША) і SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Аб'ём рэакцыйнай сумесі для ПЦР складаў 20 мкл і змяшчаў 1,5 мкл разведзенай кДНК і 0,2 мкМ кожнага праймера. Праймеры былі распрацаваны кампаніяй OligoPerfect Designer (Invitrogen, Валенсія, Каліфорнія) і выраблены кампаніяй Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Кітай) (табліца 1). Выкарыстоўваліся наступныя ўмовы тэрмацыкліравання: пачатковы этап актывацыі палімеразы пры 94°C на працягу 2 хвілін, затым 40 цыклаў па 15 секунд кожны пры 94°C для дэнатурацыі матрыцы, адпал на працягу 1 хвіліны пры 60°C, падаўжэнне і флуарэсцэнцыя. Вымярэнні праводзіліся на працягу 1 хвіліны пры 72°C. Усе ўзоры ампліфікавалі тры разы, і сярэдняе значэнне выкарыстоўвалася для аналізу RT-qPCR. Дадзеныя ампліфікацыі былі прааналізаваны з дапамогай FlexStation 3 (Molecular Devices, Санівейл, Каліфорнія, ЗША). Экспрэсія генаў IL-4, IL-17 і IFN-γ была нармалізавана адносна эндагеннага кантролю (ACTB). Адносныя ўзроўні экспрэсіі мэтавай мРНК былі разлічаны з выкарыстаннем метаду 2-ΔΔCT.
Агульны бялок быў выняты з тканін з дапамогай гамагенізатара тканін у буферы для лізісу RIPA (які змяшчае кактэйль інгібітараў пратэазы і фасфатазы), а затым цэнтрыфугаваны пры 13 000 абаротаў у хвіліну на працягу 20 хвілін пры 4°C для выдалення рэштак тканін. Пяцьдзясят мікраграмаў бялку было загружана на паласу, падзелена з дапамогай 10% SDS-PAGE, а затым перанесена на мембрану PVDF. Блакіроўка праводзілася ў 5% абястлушчаным сухім малацэ ў Tris-буферным фізіялагічным растворы (TBS), які змяшчае 0,1% Tween 20, на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы. Мембрану інкубавалі з першаснымі антыцеламі труса супраць дэкарыну (разведзенымі 1:200; Boster, Ухань, Кітай) (разведзенымі 1:200; Bioss, Пекін, Кітай) на працягу ночы пры 4°C і рэагавалі на другі дзень; з другаснымі антыцеламі (казіны антыглабулін G супраць труса ў развядзенні 1:40 000) у спалучэнні з пераксідазай хрэна (Boster, Ухань, Кітай) на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы. Сігналы вестэрн-блот-аналізу выяўляліся па павелічэнні хемілюмінесцэнцыі на хемілюмінесцэнтнай мембране пасля рэнтгенаўскага апраменьвання. Для денсітаметрычнага аналізу блоты сканавалі і колькасна вызначалі з дапамогай праграмнага забеспячэння BandScan, а вынікі выражалі ў выглядзе суадносін імунарэактыўнасці мэтавага гена да імунарэактыўнасці тубуліну.
Статыстычныя разлікі былі выкананы з выкарыстаннем праграмнага пакета SPSS16.0 (SPSS, ЗША). Дадзеныя, сабраныя падчас даследавання, былі выражаны ў выглядзе сярэдняга значэння ± стандартнае адхіленне (сярэдняе ± SD) і прааналізаваны з дапамогай аднафактарнага дысперсійнага аналізу з паўторнымі вымярэннямі (ANOVA) для вызначэння адрозненняў паміж дзвюма групамі. Значэнне p < 0,05 лічылася статыстычна значным.
Такім чынам, стварэнне жывёльнай мадэлі МК шляхам імплантацыі аўталагічных наначасціц у цела пазванка і правядзення макраанатомічнага назірання, МРТ-аналізу, гісталагічнай ацэнкі і малекулярна-біялагічнага аналізу можа стаць важным інструментам для ацэнкі і разумення механізмаў МК у чалавека і распрацоўкі новых тэрапеўтычных умяшанняў.
Як цытаваць гэты артыкул: Han, C. et al. Жывёльная мадэль зменаў Модзіка была створана шляхам імплантацыі аўталагічнага пульпознага ядра ў падхрышчавую косць паяснічнага аддзела хрыбетніка. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Вайсхаупт, Д., Занеці, М., Ходлер, Дж. і Боос, Н. Магнітна-рэзанансная тамаграфія паяснічнага аддзела хрыбетніка: распаўсюджанасць кіл і рэтэнцыі дыска, кампрэсіі нервовых карэньчыкаў, анамалій канцавых пласцінак і астэаартрозу фасеткавых суставаў у асімптаматычных добраахвотнікаў. частата. Радыялогія 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, і Leboeuf-Eed, K. Змены Modic і іх сувязь з клінічнымі вынікамі. Еўрапейскі часопіс па хрыбетніку: афіцыйнае выданне Еўрапейскага таварыства па хрыбетніку, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі хрыбетніка і Еўрапейскага таварыства даследаванняў шыйнага аддзела хрыбетніка 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Куісма, М. і інш. Мадыфікаваныя змены ў канцавых пласцінах паяснічных пазванкоў: распаўсюджанасць і сувязь з болем у паясніцы і радыкулітам у мужчын сярэдняга ўзросту, якія працуюць. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
дэ Рус, А., Крэсэль, Х., Спрытцэр, К. і Далінка, М. МРТ змяненняў касцявога мозгу каля канцавой пласцінкі пры дэгенератыўных захворваннях паяснічнага аддзела пазваночніка. AJR. Амерыканскі часопіс радыялогіі 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Модзіч, М.Т., Штайнберг, П.М., Рос, Дж.С., Масарык, Т.Дж. і Картэр, Дж.Р. Дэгенератыўнае захворванне дыскаў: ацэнка змяненняў пазваночнага мозгу з дапамогай МРТ. Радыялогія 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Модзіч, М.Т., Масарык, Т.Дж., Рос, Дж.С. і Картэр, Дж.Р. Візуалізацыя дэгенератыўных захворванняў дыска. Радыялогія 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Енсен, Т.С. і інш. Прагназуючыя змены сігналаў неавертэбральнай канцавой пласцінкі (Modic) у агульнай папуляцыі. Еўрапейскі часопіс па хрыбетніку: афіцыйная публікацыя Еўрапейскага таварыства па хрыбетніку, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі хрыбетніка і Еўрапейскага таварыства даследаванняў шыйнага аддзела хрыбетніка, аддзел 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Альберт, Х.Б. і Маніш, К. Змены Модзіка пасля кілы паяснічнага дыска. Еўрапейскі часопіс па хребтоведке: афіцыйная публікацыя Еўрапейскага таварыства па хребтоведке, Еўрапейскага таварыства дэфармацыі хрыбетніка і Еўрапейскага таварыства даследаванняў шыйнага аддзела хрыбетніка 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. і Kaapa, E. Змены тыпу Modic I могуць прадказаць хутка прагрэсавальную дэфармацыйную дэгенерацыю дыска: 1-гадовае праспектыўнае даследаванне. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Ху, З.Дж., Чжао, Ф.Д., Фан, Х.К. і Фан, С.В. Змены мадыкулёзу: магчымыя прычыны і ўклад у дэгенерацыю паяснічнага дыска. Медыцынскія гіпотэзы 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Крок, Х.В. Разрыў унутранага дыска. Праблемы з выпадзеннем дыска на працягу 50 гадоў. Пазваночнік (Філа Па 1976) 11, 650–653 (1986).
Час публікацыі: 13 снежня 2024 г.